液相色谱-串联质谱法测定牛奶中万古霉素和去甲万古霉素残留

郭启雷，史海良，杨红梅，王 浩，刘艳琴

（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

动物源性食品中抗生素的残留一直是威胁食品安全的重大隐患之一。虽然国家已经颁布了相关管理条例，但是由于各种原因，我国动物源性食品中抗生素残留问题依然存在。万古霉素（Vancomycin）和去甲万古霉素（Norvancomycin）属于糖肽类抗生素[1-2]，分子中含有糖及肽链结构，在临床常用于由革兰阳性菌尤其是葡萄球菌、肠球菌和肺炎链球菌所致严重感染性疾病的治疗。由于与其他抗生素截然不同的分子结构，对于常见抗生素的耐药菌株来说，万古霉素通常是其唯一有效的治疗药物，代表着治疗这些严重感染性疾病的最后防线。传统上，万古霉素被用作“最后一线药物”，用来治疗其他抗生素无效的严重感染。万古霉素的滥用，会造成超级耐药菌的出现和个体对常规抗生素的耐受，给临床抗感染治疗带来极大困难，可能面临无药可用的困境。另外，万古霉素本身具有一定的耳毒性和肾毒性。目前，对万古霉素的含量测定研究多集中在医药卫生领域，研究对象涉及血清、血浆、尿液及药物制剂[2-7]。动物源性食品基质复杂，本文选择牛奶为研究对象，优化适宜的提取、净化和富集方法，采用液相色谱-质谱联用技术，利用其强大的定性能力，排除基质干扰，准确定性，同时利用其高灵敏度特性对牛奶中的万古霉素、去甲万古霉素的残留量进行准确定量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、乙腈、甲酸 美国Fisher公司，色谱纯；乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、氨水、三氯乙酸 国药集团化学试剂有限公司，分析纯；Oasis MCX（60mg，3 mL）固相萃取小柱 美国waters公司；万古霉素、去甲万古霉素 中国药品生物制品检定所。

Agilent 1200高效液相色谱仪 Agilent 6410A三重四极杆串联质谱仪（配电喷雾离子源，ESI），美国Agilent公司；Milli Q超纯水发生器 美国密理博公司；电子天平，感量0.0001、0.01g 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GL-88B旋涡混合器 其林贝尔仪器制造有限公司；KQ5200超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18柱，150mm×2.1mm（id），3.5μm；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表1；流速：0.2 mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Elution gradient of HPLC

1.2.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI源）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；干燥气温度：350℃；干燥气流速：10L/min；雾化器压力；40psi；毛细管电压：4000V。定性离子对、定量离子对、碰撞能量见表2。

表2 万古霉素和去甲万古霉素的质谱参数Table 2 MS parameters of vancomycin and norvancomycin

1.2.3 样品处理 称取牛奶样品5.0g（精确至0.01g）于25mL比色管中，加入5mmol/L EDTA-1%三氟乙酸水溶液定容至25mL，涡旋混匀，超声提取15min，过滤后取10mL滤液转移至Oasis MCX固相萃取柱（预先用甲醇和1%三氟乙酸水溶液各5mL活化、平衡），先后用5mL水、甲醇淋洗，弃去淋洗液。用5mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液并于缓慢氮气流下将有机相吹干。样品用50%甲醇水溶液复溶并定容到1.0mL，混匀，过0.22μm有机相滤膜，供LC-MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

万古霉素是多肽类抗生素，分子量为1448，进入一级质谱后，与两个H+结合，产生带正电的双电荷离子，因此选择丰度最大的[M+2H]2+m/z 725.3作为万古霉素的母离子。产生碎片离子主要有m/z 99.9、m/z 143.9、m/z 1306.4（见图1（a）），选择丰度最大的m/z 99.9为定量离子，m/z 143.8为定性离子。类似的，去甲万古霉素的分子量为1433，选择双电荷离子m/z 718.0作为去甲万古霉素的母离子。产生碎片离子主要有m/z 99.9，m/z 144.0、m/z 1292.0（见图1（b）），选择丰度最大的m/z 144.0为定量离子，m/z 99.9为定性离子。

2.2 液相条件的选择

图1 二级质谱图Fig.1 Product ion spectra

图2 多反应监测质量色谱图Fig.2 Multiple reaction monitoring（MRM）chromatogram

多肽类抗生素本身带有的氨基、羧基和酚羟基，实验比较了0.1%甲酸水溶液-乙腈、水-乙腈、5mmol/L乙酸铵-乙腈对离子化的影响。结果表明，0.1%甲酸水溶液-乙腈体系能使多肽类在质谱中有最好的响应值，这是由于甲酸可以为阳离子的形成提供必需的质子来源，从而提高其离子化效率，因此选用甲酸作为酸度调节剂。由于牛奶样品基质的复杂性，采用梯度洗脱程序，待万古霉素和去甲万古霉素出峰后采用大比例有机相冲洗色谱柱，提高色谱柱的耐受性和方法的重现性，在优化后的分析条件下，万古霉素和去甲万古霉素的多反应监测质量色谱图见图2。

表3 牛奶中万古霉素、去甲万古霉素的线性范围、线性方程、检出限及回收率Table 3 Linear ranges，regression equations，LOD，recovery and repeatability for 2 polypeptides in milk

2.3 线性范围、回收率和精密度

用空白样品提取液制备基质标准曲线，万古霉素和去甲万古霉素的线性方程、线性范围和相关系数见表3。以信噪比为3估算检出限（LOD），2种多肽抗生素的检出限见表3。通过相同浓度的基质标准溶液和溶剂标准溶液的峰面积比值计算，万古霉素和去甲万古霉素的基质效应为分别为92.5%和99.1%，显示本方法前处理的良好效果。

采用经测定不含有万古霉素、去甲万古霉素的牛奶样品，进行添加回收和精密度实验，样品添加20、50、100μg/kg的标准溶液，按本实验方法进行处理，用高效液相色谱-串联质谱进样测定。平均添加回收率（每个添加浓度平行测定5次）为72.5%～87.2%，相对标准偏差小于10%，结果见表3。采用本方法对市场上的20例牛奶样品进行检测，未发现阳性样品。

3 结论

本文以牛奶为研究对象，采用三氯乙酸沉淀蛋白，混合型阳离子交换固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱定性定量分析，建立了牛奶中万古霉素和去甲万古霉素残留的检测方法，方法加标回收率为72.5%～87.2%，相对标准偏差小于10%。该方法操作简单，具有较高的灵敏度和选择性，满足对牛奶中多肽类抗生素的快速、准确的检测要求。

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