MicroRNA在肿瘤分子诊断中的应用

欧志英 夏慧敏

miRNA作为一类重要的参与基因表达调控的分子，代表了一种新的基因表达调控模式，它在细胞中调节约30%的蛋白编码基因，在致病过程中起着重要作用。miRNA是1993年继小干扰RNA(siRNA)后新发现的一类内源性非编码单链RNA分子，长约19～25 nt。从发现首个miRNA开始，短短十几年时间，用生物信息学与分子克隆的方法已经发现和证实了1921条人细胞编码的miRNA （Sanger miRBase数据库http://www.mirbase.org/）。miRNA在大多数真核生物中表达，如真菌、植物、动物[1]。miRNA通过阻断翻译或诱导靶mRNA降解，在转录后水平调节基因表达，从而精细地调节多种生物学过程，包括生长发育、信号转导、免疫调节、细胞死亡、细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖及肿瘤发生等[2]。

miRNA作为大量靶基因的内源性沉默子，在基因表达调控方面发挥着重要作用。近年来，越来越多的证据表明异常的miRNA表达是人类疾病的标志，包括肿瘤。人类肿瘤miRNA表达模式与肿瘤诊断、分期、进展、预后及对治疗的反应密切相关[3]。miRNA异常表达已在多种人类恶性肿瘤中被发现，而且与肿瘤的发生、预测、诊断、分期、进程、治疗和预后明显相关。miRNA的研究将使人们更深入地理解肿瘤的发生、进展、转移、治疗和预后监测。差异表达的miRNA在疾病诊断和治疗中的价值逐渐显现，可作为疾病早期诊断、分子分型及预后判断的指标，同时也可成为多种肿瘤耐药新的治疗靶标。因此，miRNA在多种肿瘤中可作为诊断性、预测性和治疗性的生物标志。

1 miRNA的检测方法

目前检测miRNA的方法有多种，如基因芯片、PCR芯片、荧光定量PCR、Northern Blot、原位杂交、下一代深度测序等。荧光定量PCR方法有基于锁核酸技术和基于polyA加尾法的检测技术。高通量检测有miRNA芯片检测、PCR芯片检测及全基因组miRNA深度测序分析。miRNA芯片检测、PCR芯片检测适用于对已知的miRNA进行分析和检测。miRNA高通量测序采用新一代测序技术对基因组中指定大小的miRNA分子进行高通量测序，无需知道miRNA的序列信息就可以对miRNA的表达谱进行分析。miRNA深度测序流程如图1。

图1 miRNA深度测序流程图Figure 1 Technological process of miRNA deep sequencing

目前市面上较流行的基于锁核酸技术的miRNA表达谱芯片集成了1921条人源miRNA，通过该芯片分析可检测出各种miRNA的表达水平，即高表达或低表达，该方法是高通量的检测方法，1块芯片可对1921条人源miRNA同时检测，miRNA芯片表达结果还需要荧光定量PCR进行进一步验证。

PCR芯片是利用2块384孔PCR反应板进行检测，原理是用SYBR®Green染料荧光定量PCR。PCR反应板上加入了特异性的miRNA引物对，1次可以检测742条人源miRNA。第一块板上集成了高表达、很可能是疾病差异表达并在文献中经常出现的miRNA引物对；第二块板上集成了第一块板上没有的最重要的miRNA引物对。2块PCR反应板上都包含有校正内对照和6条参考基因的检测引物对：即3个小RNA参考基因（人源U6、SNORD38B和SNORD49A，鼠和兔来源的U6 snRNA、RNU5G和RNU1A1）和3个 miRNA参考基因（miR-103、miR-191和 hsa-miR-423-5p或 mmu-miR-423-3p）。

Alhasan等开发了一种分子荧光为基础的检测系统，即Scanometric miRNA（Scano-miR）检测平台[4]，可用于检测相对低丰度的miRNA,具有高特异性和很好的重复性。特异性达到1个碱基错配。ScanomiR可以检测血清中1 fM浓度的miRNA。同一检测条件下，88%低丰度的miRNA靶标用其他方法不能检测出来。应用Scano-miR于高密度芯片模式表明它可用于不同来源标本的高通量和多种miRNA表达模式检测。研发人员用前列腺癌标本评价了平台系统的准确性，前列腺癌相关的miRNA检测准确度达到98.8%，在miRNA生物标志的表达模式、临床鉴定和研究中，该技术的应用前景广阔。

miRNA荧光定量PCR和miRNA 芯片更多关注miRNA的表达和定量检测，仅局限于检测已知的miRNA，无法探知新的miRNA分子。采用下一代深度测序技术，能够直接对样本中指定大小的miRNA分子进行高通量测序，可以在无需任何miRNA序列信息的前提下研究miRNA种类及其表达谱，亦可发现和鉴定新的miRNA分子，提供更加全面的miRNA表达研究方法，加快新miRNA的发现，是当前miRNA表达研究最有力的工具。

2 miRNA在肿瘤诊断、预后判断中的作用

miRNA是细胞中的非编码RNA，是基因表达的关键调节子，调节多种细胞生物学过程，如细胞分化、细胞周期、细胞增殖、凋亡及血管生成，这些生物学过程在肿瘤形成中起重要作用，其表达模式的改变与肿瘤发生和进展密切相关。miRNA通过与肿瘤形成有关的生物分子靶向结合，既可以作为肿瘤促进子（tumor promoters，oncomiRs）促进肿瘤生长，也可以作为肿瘤抑制子（tumor suppressors）抑制肿瘤生长。最近有研究表明miRNA在实体瘤和血液肿瘤中表达异常，这些独特的高稳定的miRNA表达模式似乎与年龄、种族无关，这些特点说明miRNA在肿瘤诊断和预后判断中的应用。miRNA异常表达与肿瘤的发生和进展相关，某些miRNA表达逆转可调节肿瘤的进展，表明miRNA可作为潜在的抗肿瘤药物靶标。因此，miRNA既可作为肿瘤标志，也可作为潜在的肿瘤新治疗靶标。血清miRNA具有丰富、高度稳定的特点，最近在多种实体瘤中被描述为潜在的循环标志，在肿瘤的早期诊断、分期、复发、预后判断及对化疗药物的耐药性或敏感性检测等方面具有重要的指示作用。

2.1 miRNA与非小细胞肺癌诊断、血管生成

非小细胞肺癌是世界范围的第一大死因，大多病例是在疾病的晚期才得到诊断。miR-15b和miR-27b能区分非小细胞肺癌病人和健康人群，血清miR-15b和miR-27b在非小细胞肺癌早期（Ⅰ期和Ⅱ期）诊断方面具有高敏感性、高特异性、阳性预测值和阴性预测值[5]，具有敏感、特异、廉价的特点。

血管生成是肿瘤发展过程中的重要事件，目前抗血管生成用于非小细胞肺癌病人的治疗。对非小细胞肺癌病人的石蜡包埋组织通过芯片杂交筛选，实时荧光定量PCR和原位杂交方法验证，最终得出miR-155是最令人感兴趣的侯选标志。在非小细胞肺癌中，与血管生成相关的miR-155表达显著改变[6]，但其生物学功能和临床相关性需要进一步验证。

miR-21在铂类耐药中表达明显升高，可预测以铂为佐剂的化疗药物的反应和非小细胞肺癌病人的无病生存期，也可能是一个新的预示铂类化疗药物疗效的分子标志。

2.2 miRNA与肝癌早期诊断、复发、预后判断

虽然甲胎蛋白（AFP）是最常见的肝癌筛查生物标记物，但有一半的病人漏检。血清miR-15b和miR-130b联合检测对肝癌病人筛查具有重要的临床意义，其敏感性和特异性分别为98.2%和91.5%，对低AFP（小于20 ng/mL）肝癌病人敏感性高达96.7%[7]，这对早期肝癌病人检测具有重要的意义。

肝细胞癌（hepatocelluar carcinoma, HCC）中有4个miRNA过表达，这4个miRNA位于19号染色体的miRNA族（C19MC）中。同活检确定的发育异常组织相比，早期HCC患者C19MC显著过表达。C19MC miRNA高水平与较差的临床病理特征一致，增加了肿瘤复发的风险，缩短了总的存活时间。C19MC是肝癌的一个新的分子特征变化，也是较差预后的一个预测指标。C19MC是肝癌治疗中引人注目的侯选分子[8]。Han等研究105例HCC病人，6个表达变化显著的microRNA（表达变化大于2倍，有miR-19a、miR-886-5p、miR-126、miR-223、miR-24 和miR-147）进一步被荧光定量RT-PCR方法证实。最后该结果在独立的50个病人的队列研究中进行证实，这些miRNA在肝癌复发中起着关键作用[9]。研究结果表明不同肝癌复发的病人miRNA表达模式，这6个miRNA标志可能作为肝癌肝移植病人预后判断的重要生物标志。

2.3 miRNA与胃癌诊断、复发及预后

同健康人相比，胃癌病人血浆中miR-451和miR-486明显增高[10], 术后血浆中明显降低，miR-451和miR-486是胃癌筛查有用的生物标志物。

Tsai等对72例胃癌标本进行分析，原发性胃癌组织标本的胞外miR-196a表达水平明显比癌旁组织高。胞外miR-196a水平与胞内水平一致，胃癌病人及胃癌复发病人血清miR-196a明显增加。miR-196a异位表达促进了上皮细胞-间充质细胞的转变及转化细胞的转移/浸润能力，表明其在胃癌形成中具有致癌潜力。所以，miR-196a在胃癌形成中起着致癌作用，可能是诊断和监测胃癌是否复发的新标志[11]。同时，miR-196a 过表达与胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors）的转移、高风险分级、低生存率有关[12]。miR-107在胃癌组织中表达明显上升，它是通过与DICER1 mRNA靶向结合促进肿瘤浸润和转移。miR-107表达与肿瘤浸润的深度、淋巴结转移及肿瘤分期明显相关。Kaplan-Meier生存曲线分析表明，miR-107高表达比低表达的病人总的存活率和无病生存率明显较差。COX多变量分析表明，miR-107表达是胃癌病人总存活率和无病生存率的独立的预后因子，miR-107是预测胃癌较差预后的有效生物标记[13]。

2.4 miRNA与食道鳞状细胞癌诊断与预后判断

食道鳞状细胞癌血清miR-21浓度明显比健康人高（P＜0.001），术后比术前明显降低（P=0.003）。而且，对化疗药物敏感的食道鳞状细胞癌患者，血清miR-21水平明显减少（P=0.003），而对化疗药物不敏感的食道鳞状细胞癌患者血清miR-21水平没有明显的变化。故miR-21被认为是诊断食道鳞状细胞癌的新标志，也可以当作对化疗药物反应的标志[14]。miR-1322通过等位特异的形式下调食道肿瘤相关基因 2（esophageal cancer related gene 2， ECRG2）的表达：下调有等位基因TCA3位点的ECRG2基因表达（P＜0.01），而不下调有等位基因TCA4位点的ECRG2基因表达（P＞0.05）[15]，血清 miR-1322表达水平可作为食道鳞状细胞癌病人潜在的诊断生物标志。食道癌中miR-143和miR-145可以调节原癌基因Fascin Homolog 1（FSCN1）的表达，参与转移的调节，说明miR-143和miR-145可作为食道癌早期诊断和预后判断的生物标志[16]。

2.5 miRNA与结直肠癌诊断、预后判断、化疗敏感性

miRNA对结直肠癌具有预测和治疗的价值。结直肠癌患者miR-375表达下调，癌组织和癌旁组织中差异显著（P＜0.001; paired t-test），但这种下调与肿瘤大小、肿瘤分级、pT分级、pN分级无关，所以miR-375也可能是结直肠癌诊断的潜在的生物标志[17]。另一个研究表明结直肠癌患者粪便miR-143和miR-145表达水平明显比正常组织低（P＜0.05, 2-ΔΔct均值），故粪便miRNA检测可作为潜在的结直肠癌诊断或筛查的方法[18]。

同正常癌旁组织相比，miR-22在正常结肠癌组织中明显低表达，这种低表达与肝脏转移有关，Kaplan-Meier分析表明，miR-22低表达，总的存活率低。而且多变量分析表明，miR-22表达减少是总的存活率的独立预测因子[7]，结果表明miR-22是结直肠癌一个新的、潜在的预后判断指标。

miR-93过表达抑制结直肠癌的增殖和转移，但与侵袭无关，使细胞周期停留在G2期，不诱导细胞凋亡和坏死。功能研究表明miR-93可抑制CCNB1蛋白表达，使细胞周期停留在G2期。而且miR-93表达抑制了细胞增殖相关基因如ERBB2、p21和VEGF的表达[19]，表明miR-93可以抑制肿瘤发生，减少结直肠癌的复发，对结直肠癌复发的预测有重要意义。

miR-143在结直肠癌中下调，影响结直肠癌细胞增殖、凋亡及对5-氟尿嘧啶的敏感性，同时miR-143与K-Ras原癌基因mRNA靶向结合[20]，这些都说明miR-143是一个新的结直肠癌预测分子和有应用前景的药物靶标。结直肠癌病人miR-21表达明显增高，利用实时荧光RT-PCR反应检测，敏感性为80%，特异性为88.2%，在癌组织中miR-21明显高表达[21]，可作为潜在的候选生物标志，可能是预测肿瘤是否对化疗药物敏感的、潜在的候选预测分子。

2.6 miRNA与肾细胞癌的早期诊断及预后判断

肾细胞癌是成人肾脏中最常见的赘生物，目前没有肾细胞癌病人复发的早期诊断、标准血清生物标志物。一项研究检测了30例肾细胞癌病人和健康人miRNA的差异表达：癌症病人血清中19种miRNA表达上调，11种miRNA下调。肾细胞癌病人血清中miR-378表达增加（P=0.0003, AUC=0.71）， miR-451表达下降（P＜0.0001, AUC=0.77），血清 miR-378和miR-451联合检测可以鉴别肾细胞癌病人，敏感性达81%,特异性达83%（AUC=0.86）。所以，血清中循环miRNA可能是肾细胞癌早期诊断的很有应用前景的标志物[22]。

目前尚无肾细胞癌肾切除后复发风险鉴定的生物标志。利用TaqMan低通量（754个miRNA）荧光定量PCR检测分析,再用荧光定量PCR进行验证，得知miR-127-3p、miR-145和miR-126与无转移肾细胞癌无复发存活病人显著相关[23]。

2.7 miRNA与乳腺癌的无创诊断及预后判断

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%，在女性仅次于子宫癌。乳腺癌的发病常与遗传有关，年龄在40～60岁之间，绝经期前后的妇女发病率较高。严重影响女性身心健康甚至危及生命。通过基因组范围的高通量测序结合验证分析发现miR-222在乳腺癌病人血清中表达显著增加（P＜0.05），可能是一个诊断乳腺癌的生物标志物。miR-BS1是已被鉴定和证实的乳腺癌诊断标志，其作用的靶基因FOXO3和K-ras正是乳腺癌相关的信号途径中的分子[24]。miR-16, miR-25,miR-222和miR-324-3p在乳腺癌组织和癌旁组织中表达差异明显，血清中这4种miRNA联合检测在乳腺癌早期敏感性为0.917，特异性为0.896，中晚期敏感性为0.921，特异性为0.934，所以miR-16, miR-25,miR-222和miR-324-3p联合检测可作为乳腺癌无创检测的指标[25]。

miR-21是已知的原癌基因，miR-21高表达与乳腺切除，肿瘤体积增大，分期增高，分级增加，雌激素受体（estrogen receptor，ER）阴性，人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性，HER2阳性乳腺癌亚型，高Ki-67表达及死亡有关。多变量分析表明，总存活率的预后因子是ER和miR-21。miR-21在乳腺癌中高表达，可作为乳腺癌的原癌基因和生物标志，与其他预后因子和存活指标明显相关[26]。

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是指ER、孕激素受体（progestogerone receptor,PR）和HER2均阴性的一种特殊类型乳腺癌，年轻女性具有高发病率，预后极差。TNBC约占所有乳腺癌患者的15%，其许多生物学特性与基底细胞样型乳腺癌相似，但两者之间存在某些基因表达谱和免疫表型上的差异，因此亦不能完全等同。TNBC因缺乏内分泌及抗HER2治疗的靶点，目前尚无针对性的标准治疗方案。miR-34b表达与TNBC患者的无病生存率和总生存率呈负相关，是新的、有应用前景的预后判断标志物[27]。miR-210在三阴乳腺癌病人中低表达时，无病生存期和总生存期会更长（P值分别为0.02和0.05）。虽然三阴乳腺癌病人预后较差，但COX单变量和多变量分析表明，miR-210可以作为一个独立的预后因子，高表达比低表达病人预后更差。所以，miR-210表达水平可能是临床有用的预后因子，对三阴乳腺癌病人尤其是无瘤患者辅助治疗决策起着关键作用[28]。

2.8 miRNA与卵巢癌的早期诊断

卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。miR-148b在卵巢癌病人中的表达率高达92.21%（71/77），这种高表达与卵巢癌病人的临床病理特征无关[29]，所以miR-148b是早期卵巢癌的重要标志，可作为有效的临床诊断生物标志。Pleiotrophin （PTN）是发育调节生长因子，广泛分布在不同的正常组织和癌组织中，在不同物种中高度保守，大脑、心脏、输卵管中PTN mRNA表达丰富。研究发现miR-499和miR-1709通过与PTN 3'-UTR结合从而影响基因表达，是通过转录后基因表达调控模式进行调节[30]。PTN是卵巢上皮癌的重要生物标志，可用于疾病的早期诊断和监测治疗效果。

2.9 miRNA与其他肿瘤的早期诊断与预后判断

通过定量RT-PCR分析miRNA的表达及免疫组化分析相应靶蛋白的表达，证明miR-224上调可表明甲状腺髓样癌病人有好的预后[31]，是甲状腺髓样癌病人较好的预后判断分子标记。miR-181b是慢性淋巴细胞性白血病疾病进程有应用前景的标志物[32]。通过对82例恶性胶质瘤病人进行全基因组深度测序分析，miR-181d可作为恶性胶质瘤发生的预测生物标志，其作用可能是通过转录后下调甲基-鸟嘌呤-甲基转移酶（methyl-guanine-methyl-transferase）基因的表达[33]。miR-103在恶性间质瘤中表达比正常人群和石棉暴露对照组都高，作为区分恶性间质瘤和石棉暴露对照组时，其敏感性和特异性分别为83%和71%。作为区分恶性间质瘤和正常对照组时，其敏感性和特异性分别为78%和76%[34]。

黑素瘤的发病率增长迅速，皮肤活检的组织学检查是黑素瘤诊断和预后判断的金标准。良性和恶性病变在形态学上的重叠使得诊断变得更加复杂，肿瘤厚度并非准确的预后预测因子。通过芯片分析和定量RT-PCR验证获得一系列差异表达的miRNA,在良性的痣和原发性或转移性黑色素瘤中，找到20个差异表达显著的miRNA，大多数在黑色素瘤中表达下调，miR-203和miR-205在原发性和转移性黑素瘤中表达有显著差异。体外功能分析实验中，miR-200c和miR-205抑制了不依赖锚地的集落形成，miR-211过表达既抑制不依赖锚地的集落形成，也抑制肿瘤浸润[35]。这些指标可作为黑色素瘤的有用诊断或预后指标，miR-200c、miR-205和miR-211可作为黑色素瘤抑制子。

前列腺癌患者尿样中miR-107和miR-574-3p浓度比正常人增加3倍以上，差异具有统计学意义。通过分析前列腺癌病人不同体液miRNA浓度变化，其中循环miRNA有可能作为前列腺癌诊断、分期和预测的标志物[36]。越来越多的证据表明子宫内膜癌中存在miRNA表达异常。miR-205是子宫内膜癌的一个独特的潜在的预后标志[37]。在子宫内膜癌预后判断中具有重要意义。

多种植物类化疗药如表没食子儿茶素、姜黄素、异黄酮、吲哚-3-甲醇、白黎芦醇及异硫氰酸盐可以调节肿瘤细胞中多种miRNA的表达，导致肿瘤细胞生长终止或使肿瘤细胞对化疗药物更敏感[38]。

3 结语

miRNA作为一种新近发现的调控型小分子RNA，其在生物体内起着十分重要的作用。近年来研究进展非常快速，在miRNA的生物合成过程中，还有很多疑问尚未解决，如miRNA基因在转录水平的调控，它本身的表达又由什么来决定呢?

从外周血中鉴定特异的miRNA有望成为肿瘤无创诊断或预后判断、潜在的生物标志。最近，有报道检测到了血清/血浆中存在循环的胞外miRNA，尽管血清/血浆中存在RNase，但miRNA在血清、血浆甚至尿液中都能稳定存在。与mRNA不同，miRNA在体内存在时间长，在体外能稳定存在，这些特点使得检测石蜡包埋组织样品的miRNA亦成为可能。miRNA是细胞中合成，在血液中能被探测到，说明这些miRNA可能是要通过血液循环传到受体细胞，在受体细胞中发挥调节靶基因翻译的作用[39]。为何循环miRNA相当稳定？一种解释就是miRNA存在于脂质或脂蛋白复合物如外来体中[40]或微囊泡中[41]。循环miRNA分子在心血管系统中具有新的令人振奋的功能可能是它们具有旁分泌信号分子的潜力[42]，但其作为旁分泌信号分子的功能仍需进一步验证。

miRNA是有效的生物分子标志，为肿瘤的早期诊断、分子分型提供了一类新的有效靶标，也可为肿瘤的侵袭性、转移性和对不同治疗方案的反应性进行比较判断。在转化医学中有着很好的应用前景，我们必须尽快建立规范、标准化的临床检测方法，并尽快完成临床应用验证。相信在不久的将来，随着研究的深入，miRNA生物标志将会逐渐运用到肿瘤临床诊断中，也将进一步提高肿瘤的诊断和治疗水平。

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