1456例女性HPV基因分型结果的回顾分析

张满娥 黄文蓉 张洪彬

•论 著•

1456例女性HPV基因分型结果的回顾分析

张满娥 黄文蓉 张洪彬

目的了解龙岩地区妇女HPV感染的阳性率与各年龄段的关系及各亚型的分布情况，为该地区宫颈癌防治及流行病学研究提供依据。方法采用反向斑点杂交-基因芯片法检测1456例女性宫颈脱落细胞，以进行23种HPV基因型检测，计算HPV感染的阳性率和年龄段的关系及HPV亚型感染分布特点。结果1456例标本中阳性540例，阳性率为37.09%，检测出21种HPV亚型，HPV44亚型和MM4亚型未被检出。低危亚型组主要以43亚型为主，高危亚型组优势型别依次为HPV16、58和52。HPV感染的高峰年龄为30～50岁，各年龄组的HPV阳性检出率有显著差异（P＜0.05）。结论HPV基因分型检测对宫颈癌防治有较好的指导意义。

人乳头瘤病毒；基因分型；宫颈癌

人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一种强嗜上皮性、严格宿主范围与组织特异性的DNA病毒。HPV可以通过多种途经感染生殖道而导致尖锐湿疣及宫颈病变，甚至引起宫颈癌的发生。HPV感染是宫颈上皮内瘤样变（CIN）和宫颈癌发生的必要条件，HPV检测已成为筛检宫颈癌的有效方式。HPV感染的型别分布随地理区域而变化，明确HPV在特定地区的感染率及型别分布差异能为该地区宫颈癌防治及流行病学研究提供依据及对HPV疫苗的开发应用有着重要的指导意义。为此我们对龙岩地区1456例女性HPV基因分型结果进行回顾分析，现报告如下：

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 病例来源

2011年4月至2012年4月于本院妇科就诊的女性患者1456例，年龄在17～84岁，对所研究病例以年龄段为分组依据，20岁以下为一组，60岁以上为一组，中间年龄每10年为一个年龄段，即为一组。所有患者均为初次进行HPV检测，剔除二次复查数据。

1.1.2 标本采集

医生以窥阴器暴露子宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去，取出宫颈刷深入受检者宫颈口内2～3 cm,顺时针旋转3～5圈。取出宫颈刷放入装有保存液的样品管中，将多余的刷柄折断，旋紧管盖，注明编号和日期。如不能马上检测，应将样本置于4℃存放，并在一周内完成检测，应避免反复冻融。

1.1.3 仪器与试剂

HPV基因分型检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）（深圳亚能生物技术有限公司生产），配有试剂盒Ⅰ与试剂盒Ⅱ，试剂盒Ⅰ主要为PCR反应液，试剂盒Ⅱ为HPV各基因亚型芯片、POD母液、TMB、30% H2O2以及裂解液等；PCR仪为美国ABI公司提供的ABI7000实时荧光定量分析仪，分子杂交仪为FINEPCR Combi-H12及YN 2009基因芯片阅读仪。

1.2 方法

1.2.1 HPV DNA的提取：充分洗脱宫颈刷，并在管壁上挤干。把1 mL洗脱液全部转移到1.5 mL的EP管中，13000 rpm离心10 min，弃上清液，加入50 μL裂解液充分悬浮沉淀，沸水浴加热10 min，13000 rpm离心10 min，保留上清液待用。

1.2.2 PCR扩增HPV DNA：取出PCR反应管，在管盖上做好标记，低速离心数秒，分别加入已提取的待测样本DNA 5 μL,低速离心数秒后，按下述反应条件进行PCR扩增：50℃ 15 min；95℃ 10 min，94℃ 30 s，42℃90 s，72℃ 30 s，共 40个循环；最后72℃延长5 min。

1.2.3 杂交、洗膜与显色均严格按照说明书进行。每次试验均设阴性、阳性对照作为质量控制。

2 结果

2.1 1456例标本中HPV DNA检出情况见表1

2.2 540例HPV阳性标本中高危亚型组（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66，68、73、83、MM4）、低危亚型组（HPV6、11、42、43、44）及混合感染组检测结果见表2。

2.3 不同年龄组HPV感染率见表3。

2.4 1456例标本中高危亚型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4）与低危亚型（HPV6、11、42、43、44）检出的例数分布见表4。

表1 1456例标本中HPV DNA检出情况Table 1 The infection data of HPV DNA from 1456 samples

表2 540例HPV阳性标本中高危亚型组与低危亚型组检测结果Table 2 The results of high-risk HPV types and low-risk HPV types in 540 cases of HPV positive samples

表3 各年龄组的HPV阳性率情况Table 3 The positive rate of HPV in every phase of age

表4 HPV亚型检出例数的分布情况Table 4 Distribution of the detected HPV subtypes

3 讨论

3.1 HPV基因分型检测的意义有：①明确受检者所感染的HPV病毒类型（高危型，低危型或复合型），了解患者是持续感染或新的感染；②根据感染的HPV亚型预测受检者的发病风险，以制定正确合理且有效的治疗方案和决定随访时间；③与病理检查结果相结合，发现低度病变中的宫颈癌患者；④用于治疗后的效果监测；⑤积累本地区人群HPV感染具体亚型的分布以及与年龄的关系，为研制适合中国人群的HPV预防和治疗性疫苗提供数据。

3.2 人乳头瘤病毒感染已被公认为是引起宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的主要原因，HPV检测在宫颈癌筛查中的作用已无可非议[1]。目前已发现100余种HPV亚型，有35种与生殖道疾病有关，但大多数感染是一过性的，可被自身的免疫系统清除，仅有一小部分高危型（HR-HPV）持续感染可发展为宫颈上皮内瘤变（CIN）进而发展为浸润癌。子宫颈的癌前病变（CIN）到癌是一个相对较长时间的过程，即宫颈感染HPV→CIN→原位癌→早期浸润癌→浸润癌，研究显示要经历10年左右时间[2]。HPV感染可能的致病机制：在机体免疫力低下时整合到机体的核染色体基因组上，导致p53基因失活，因而不能正常表达，进而引起细胞增殖调节失控[3]。因此，我们可以及早发现和控制感染潜伏期和中间环节，及时检测以筛查高危患者，并给予感染者防治性指导，这样便可大大降低宫颈癌的发生。

3.3 预防和治疗HPV感染的理想方法是疫苗接种。研制HPV疫苗需要了解各地区HPV型别的感染状况及流行趋势等资料和该地区HPV的感染率、感染优势型别。本研究对龙岩地区女性进行HPV基因分型，阳性检出率为37.09%，低于辽宁地区的47.28%[4]，接近重庆永川地区的37.65%[5]，高于济宁等其它地区的检出率23～31%[6～10]，这表明HPV的感染存在明显的地区差异，应针对本地区的HPV的感染分布状况,制定相应的预防措施。

3.4 在中国大陆HPV感染主要以HPV16亚型为主，居第一位，18亚型居第二位，58和52亚型分别居第三和第四位[11]。调查显示龙岩地区女性HPV感染型别分布情况为低危亚型组主要以43亚型为主，高危亚型组优势型别依次为HPV16、58和52，这与其它地区型别分布存在差异[4～10]。这一地域分布特点提示龙岩地区伴有HPV16、58和52宫颈感染的妇女发展成宫颈癌的可能性增加，同时也提示龙岩地区用于宫颈癌有效预防的HPV疫苗需要针对HPV16、58和52等型别。对于HPV52、58的感染率是否在国内其它地区也远远超过HPV18，这还有待其它地区相应的研究证实。

3.5 本调查结果显示各年龄段的阳性检出率在统计学上是有显著性差异的，这提示HPV的阳性检出率与年龄有关。表3中可见＜20岁年龄组阳性检出率较高，但样本数较少，同时为阳性百分比最低组；＞60岁年龄组阳性检出率最高，其次分别为20～30岁组和50～60岁组。 HPV感染的高峰年龄为30～50岁，而福州地区HPV感染的高峰年龄为＜20岁和40～50岁[8]，内蒙古自治区中西部地区HPV感染的高峰年龄为36～40岁[10]。本研究表明，30～50岁组占阳性标本中的阳性百分比高，因此应加强30～50岁妇女HPV的普查力度。

3.6 本调查显示龙岩地区女性HPV感染的单一型别感染率为24.86%,多重感染率为12.23%，高于内蒙古地区的多重感染率6.2%[10]；HPV高危亚型组占阳性标本的57.04%，HPV低危亚型组占阳性标本的25.00%，混合感染组占阳性标本的17.96%，低于济宁地区的复合型感染率25.3%。有报道指HPV的多重感染对宫颈病变的发展有促进作用[6]，这有待于进一步探讨。

4 结语

本调查通过对患者进行HPV检测，调查所获得的本地区HPV感染的感染率、感染优势型别以及高发年龄段等资料可为本地区宫颈癌防治提供可靠的数据，为干预宫颈癌发生、发展制定相关措施提供理论依据，降低宫颈癌的发病率，减少社会医疗开支。

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Retrospective analysis of 1456 cases of female HPV genotyping results

ZHANG Mane , HUANG Wenrong , ZHANG Hongbin
(Molecular Biology Laboratory, The Second Hospital of Longyan , Fujian Longyan 364000 , China)

Objective To investigate the relationship between the positive rate of female HPV infection and all ages and the distrubution of each subtype in Longyan region, in order to provide the basis for the prevention and control of cervical cancer and epidemiological study. Methods To detect 23 kinds of HPV genotype , calculate the relation between the positive rate of female HPV infection and all ages,the distribution characteristics of each subtype by dot blot hybridization reverse-gene chip to detect 1456 cases of female cervical exfoliated cells. Results 540 in 1456 cases were positive,with 37.09% positive rate. Among 540 positive samples, 21 subtypes of 23 known subtypes were detected .The HPV44 and MM4 subtypes had not been detected in this study.Low-risk type was mainly HPV 43 subtype and high-risk superior types were HPV 16,58 and 52. The peak age of HPV infection ranged from 30 to 50 years old.There was significant difference between different aged groups in HPV positive detection rate(P＜ 0.05). Conclusion HPV genotyping detection is meaningful in cervical cancer prevention and control.

Human papilloma virus; Gene subtypes; Cervical cancer

福建省龙岩市第二医院分子生物学实验室，福建，龙岩 364000