黄体中期GnRHa长方案中Gn刺激时间与IVF结局的关系＊

程 丹， 杨 菁， 熊承良， 徐望明， 李 洁， 邹宇洁， 郭 跃， 彭祥炽

1武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉 430060

2华中科技大学同济医学院计划生育研究所，武汉 430030

体外受精－胚胎移植（invitrofertilization and embryo transfer，IVF-ET）已经成为不孕症治疗的常规手段之一。如何提高IVF成功率，减少周期取消率，获得更好的治疗结局一直是生殖医学领域追求的目标。黄体中期促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa）长方案是目前临床上最常用，也是IVF结局较好的促排卵方案［1］。近年来越来越多的学者开始关注到促性腺激素（Gn）对卵子和胚胎质量的影响，开展了很多关于Gn剂量、Gn类型等对IVF结局影响的研究［2－5］，也有研究证实大剂量长时间的Gn暴露对卵泡的生长、卵子的发育有不良的影响［6－7］，但是目前国内外很少有关于Gn刺激时间与IVF结局关系方面的研究。Gn刺激时间能否初步预测IVF结局？多久的Gn刺激对于卵泡的生长是合适的？多长时间的Gn暴露对于卵子的不良影响较小？本研究回顾我中心初次行IVF助孕的患者资料，分析了Gn刺激时间的患者分布情况，并比较了不同Gn刺激时间的IVF结局，探讨Gn刺激时间与IVF结局间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2009年1月至2011年12月间在武汉大学人民医院生殖中心行IVF助孕的1 119例患者。纳入条件：第1次促排卵的采卵周期，患者月经周期正常，双侧卵巢存在，IVF指征为输卵管因素，应用黄体中期GnRHa长方案促排卵，受精方式为常规IVF。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 促排卵与IVF-ET

患者在前次月经周期的黄体期开始每日肌注0.1mg醋酸曲普瑞林（达必佳，辉凌公司），降调14 d后在月经周期的第3～7天开始应用基因重组Gn（Gonal-F，75U／支，默克雪兰诺公司）超促排卵，根据患者年龄、基础卵泡刺激素（bFSH），双侧卵巢窦卵泡计数（basal antral follicle count，BAFC）情况决定启动剂量（75～225U／d）。随后根据动态监测血雌二醇（E2）水平与卵泡生长情况调整Gn剂量，到主导卵泡直径达到18mm，晚间肌注人绒毛膜促性腺激素（HCG，丽珠公司）1万U，34～36h后采卵。常规体外受精，胚胎培养，第3天行胚胎移植，35岁以下患者常规移植2个胚胎，35岁以上患者根据情况移植2或3个胚胎。黄体支持方法为取卵后肌内注射黄体酮针剂（浙江仙琚药业）60mg／d。胚胎移植后12d查血βHCG确定是否妊娠，移植后30d行阴道B超检查，有孕囊确定为临床妊娠，临床妊娠者黄体支持持续6～8周。

1.3 分组

全部患者根据Gn刺激时间分为7组：≤9d、10 d、11d、12d、13d、14d、≥15d组。

1.4 观察指标

1.4.1 IVF患者一般资料 包括年龄、体重指数（BMI，kg／m2）、不育年限（infertility years IY）、bFSH（连续3次测定月经第3天bFSH，记录其平均值）和BAFC。

1.4.2 患者周期资料 包括Gn用量、HCG日E2峰值（mmol／L）、获卵数（ovum retrieval，OR）、受精数（fer-tilized）、卵裂数（cleavaged）、优质胚胎数（good quality embryoes，GQE；即OR后D3≥6细胞，碎片≤20%的胚胎）、移植周期数（embryo transfer，ET）、取消周期数（cancelled cycles，CC）和取消移植、全胚冷冻周期数（total embryo freezing，TEF）等。无可用胚胎移植病例记为CC，计算CC率（取消周期数／采卵周期数）；有优质胚胎但因为卵巢过度刺激（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）高危（移植日有一侧卵巢直径≥9cm或出现明显过度刺激症状）或提前黄素化（HCG日P≥2.5ng／mL）时取消鲜胚移植，将全部胚胎冷冻，并计算TEF率（全胚冷冻周期数／采卵周期数）。

1.4.3 IVF临床结局 包括临床妊娠率（clinical pregnancy rate，CPR；即临床妊娠周期数／移植周期数），着床率（implantation rate，IR；即孕囊个数／移植胚 胎 数），流 产 率 （spontaneous abortion rate，SAR；即流产周期数／临床妊娠周期数）和活胎分娩率（live birth rate，LBR；即28周以后活胎分娩周期数／移植周期数）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件进行数据分析，结果以±s表示。计量资料满足方差齐性条件时，采用t检验；不满足方差齐性条件，则采用非参数的Kruskal-Wallis检验；两组率的比较采用χ2检验；以P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 全组病例的周期资料

共有1 119例患者被纳入本研究，患者平均刺激时间为（11.8±1.8）d（7～18d），平均 Gn用量为（37.7±11.8）支（16～63支），平均 OR数为（12.7±3.9）个，平均获得胚胎（8.5±3.1）个，临床妊娠率47.3%，着床率28.5%，流产率6.8%，活胎分娩率38.1%。40例 （3.6%）患者因无可移植胚胎取消周期，48例（4.3%）因OHSS高危或P提前上升而取消鲜胚移植行全胚冷冻，中、重度OHSS发生率为 2.3%（26例），较文献报道稍低［8－9］。

2.2 各组患者一般情况及卵巢储备指标

Gn刺激时间的患者分布情况如表1所示。Gn刺激时间以12d者最多，共272例，占总人数的24.3%，其 余 依 次 为 11d（247 例，22.1%），13d（192例，17.2%），10d（137例，12.2%），14d（122例，10.9%），≥15d（92例，8.2%）和≤9d（57例，5.1%）。各组的年龄、BMI、不育年限、bFSH 和BAFC与全组患者的平均水平相比，差异均无统计学意义（表1）。

表1 不同Gn刺激时间患者的一般资料及卵巢储备情况（±s）Table 1 Baseline data and ovarian reserve of patients in different groups（±s）

表1 不同Gn刺激时间患者的一般资料及卵巢储备情况（±s）Table 1 Baseline data and ovarian reserve of patients in different groups（±s）

＃为合计

均值例数（%） 57（5.1） 137（12.2） 247（22.1） 272（24.3） 192（17.2） 122（10.9） 92（8.2） 1 119（100.00）项目Gn刺激时间（d）≤9 10 11 12 13 14 ≥15＃年龄（岁） 32.3±4.3 31.6±4.2 31.9±4.0 31.7±3.9 32.1±4.0 31.8±3.9 32.2±4.8 31.9±4.1 BMI（kg／m2） 20.4±1.9 20.6±2.1 21.3±1.8 20.7±1.9 20.8±2.0 21.0±1.9 21.5±1.8 20.9±1.9不育年限（年） 4.4±2.9 4.2±2.7 4.1±2.6 4.5±2.8 4.0±2.7 4.6±2.8 4.1±3.0 4.3±2.9 BAFC（个） 11.7±2.9 11.9±3.0 12.0±3.1 12.4±2.8 12.3±2.7 11.9±3.0 11.8±3.1 12.1±2.9 bFSH（ng／mL） 5.7±2.9 6.1±2.8 6.3±2.7 6.4±2.8 6.2±2.5 6.1±2.4 6.5±2.8 6.2±2.7

2.3 各组超促排卵与IVF周期情况

各组超促排卵中Gn用量、HCG日E2水平、获卵数及IVF实验室资料见表2。随着Gn刺激时间的增加，Gn用量与HCG日E2水平逐渐上升，≤9d组、10d组、14d组及≥15d组与全组资料的平均水平相比，差异有统计学意义；14d组与≥15d组获卵数与受精数最多，但卵裂数并未相应增加，12d组和13d组优质胚胎数最多，与全组均值相比差异无统计学意义。与全组均值比较，≤9d组与10d组Gn用量少，HCG日E2峰值低，获卵数少、受精数少、优质胚胎数少，周期取消率高，但全胚冷冻率与OHSS发生率较低；而14d组与≥15d组虽获卵数、受精数多，但优质胚胎数少，周期取消率与全胚冷冻率均高，发生OHSS比例也较高。

表2 各组超促排卵情况与IVF周期资料（±s）Table 2 Controlled ovarian hyperstimulation and IVF cycle data in different groups（±s）

表2 各组超促排卵情况与IVF周期资料（±s）Table 2 Controlled ovarian hyperstimulation and IVF cycle data in different groups（±s）

＃为合计；与全组资料的均值比较，＊P＜0.01

均值例数（%） 57（5.1） 137（12.2） 247（22.1） 272（24.3） 192（17.2） 122（10.9） 92（8.2） 1 119（100.0）指标 Gn刺激时间（d）≤9 10 11 12 13 14 ≥15＃Gn用量（支） 27.7±10.9＊ 33.1±11.5＊ 35.7±11.6 37.1±12.3 41.3±12.4 44.4±13.2＊ 47.7±13.9＊ 37.7±11.8 HCG日E2（nmol／L）3397±1221＊ 3877±1295＊ 4155±1339 4532±1441 4797±1502 4998±1563＊ 5143±1599＊ 4668±1332获卵数（个） 10.5±3.3＊ 11.4±3.6 12.4±4.1 12.9±4.0 13.5±4.3 14.5±4.4＊ 14.1±4.5＊ 12.7±3.9受精数 6.9±2.8＊ 8.9±3.5＊ 9.5±3.9 9.5±4.0 9.7±4.1 10.2±4.4＊ 10.1±4.1＊ 9.6±4.1卵裂数 5.6±2.7＊ 6.7±3.1＊ 7.2±3.3 7.3±3.7 7.4±3.8 7.4±3.5 7.1±2.9 7.3±3.1优质胚胎数（个） 3.8±1.5＊ 4.4±1.9＊ 4.9±2.1 5.5±2.6 5.7±2.6 5.4±2.3 4.7±1.8＊ 5.5±2.2周期取消率（%） 5（8.7）＊ 4（2.9） 7（2.8） 7（2.6） 5（2.6） 6（4.9）＊ 6（6.5）＊ 40（3.6）＃全胚冷冻率（%） 1（1.8） 3（2.1） 6（2.4） 9（3.3） 7（3.6） 12（9.8）＊ 10（10.9）＊ 48（4.3）＃OHSS发生率（%） 1（1.8） 2（1.5） 3（1.2） 4（1.5） 4（2.1） 6（4.9）＊ 6（6.5）＊ 26（2.3）＃

2.4 各组IVF治疗结局

如表3所示，Gn刺激时间少于10d者IVF结局较差，刺激时间在11～13d者IVF结局最好，表现为更高的临床妊娠率、着床率、活胎分娩率和较低的流产率。而随着刺激时间的增加，IVF结局并没有相应提高，刺激时间超过14d者临床妊娠率、着床率、活胎分娩率明显降低，而流产率较高。

表3 不同Gn刺激时间患者的IVF治疗结局（%）Table 3 The profiles of IVF outcomes in different groups（%）

3 讨论

在IVF控制性超促排卵方案中GnRHa长方案的应用是一个里程碑式的发展，GnRHa长方案通过在前次月经周期的黄体期开始应用GnRH的类似物占领垂体的受体达到抑制垂体的目的，从而在卵泡生长早期抑制内源性的激素分泌，避免出现过早的黄体生成素（LH）峰［10］，使卵泡对外源性的Gn有更好的反应，刺激多个卵泡同步发育成熟。长方案应用于IVF临床已经超过25年，通过长方案获得多个同步发育成熟的卵母细胞体外培养受精，使IVF效率大为提高，明显提高了IVF临床妊娠率，使其成为治疗不育症的常规方法。

IVF治疗结局与卵子质量息息相关，获得优质的卵子才能得到优质的胚胎，从而获得高的临床妊娠率，降低妊娠丢失率。因此获得好的IVF治疗结局的关键就是能够获得高质量的卵子。很多研究人员都关注到IVF促排卵药物对卵子质量的影响［11］，有很多关于Gn剂量、剂型等对卵子质量影响的相关报道，但目前尚未见关于Gn刺激时间与IVF结局之间关系的报道。

本研究通过回顾性分析1 119例应用GnRHa长方案促排卵行IVF的临床资料，比较了Gn刺激时间与IVF结局之间的关系。结果发现Gn刺激时间与IVF结局有关，刺激时间过长（≥14d）与过短（≤10d）均预示着不良的IVF结局，刺激时间在11～13d时IVF临床结局最佳。刺激时间太短导致IVF结局不良可能是由于卵泡生长过快，导致卵细胞胞质与胞核发育不同步，胞核成熟而胞质不成熟，影响卵子质量或导致空卵泡综合征，因此Gn刺激少于10d的2组尽管卵巢储备功能的指标无差异，但促排卵后可用胚胎较少，周期取消率较高。

有研究报道对于高龄低反应的患者单纯增加Gn剂量，延长Gn刺激时间可能增加获卵数，但并不能改善IVF治疗结局，也不能降低周期取消率［12－13］。我们的研究也得出相同的结论，当 Gn刺激时间超过14d时，尽管获卵数有所增加，但是无可移植胚胎的周期取消率明显增加，而且由于提早黄素化（premature luteinization，PL）［14－15］引起卵泡发育与内膜生长不同步，种植窗提早关闭而取消新鲜胚胎移植的周期比例明显增加。本组资料中依照文献报道［16－18］当 HCG日孕酮（P）水平超过2.5ng／mL定义为提早黄素化，取消新鲜周期移植。由于提早黄素化或OHSS高危（移植日有一侧卵巢直径大于9cm或已经出现明显OHSS症状）而取消鲜胚移植的全胚冷冻率为4.3%，与文献报道相仿。

Al-Ghamdi等［19］的研究发现过高的Gn刺激可能降低临床妊娠率和活产率，而提高流产率。我们的资料也证实了这样的结论。本组资料发现当Gn刺激时间超过14d时，流产率明显增加。有文献［20］报道大量外源性Gn对胚胎着床与着床后胎儿发育的不良影响。尽管其确切的影响机制以及Gn用量与流产率之间是否存在一定的量效关系尚不完全明了，但有研究证实大剂量外源性Gn可能影响生长中卵泡内的颗粒细胞［21－22］。体外研究也证实大剂量的外源性Gn对卵子中的纺锤体形成与染色体分离有不良的影响，确切的作用途径与关系尚有待于进一步研究证实。

Gn刺激时间过长或过短都预示着不良的IVF治疗结局，可能与促排卵过程中Gn启动剂量、Gn剂量的调整不当等有关。当患者初次IVF治疗失败需要重复助孕治疗时，前次促排卵治疗经过对于以后的促排卵方案、Gn启动剂量、Gn剂量的调整、促排卵时间的控制等都有非常重要的指导意义。

总之，Gn刺激时间与IVF治疗结局有关，适当的Gn刺激预示着较好的IVF治疗结局，过长与过短的Gn刺激都可能导致不良的治疗结局。但是本研究仅为回顾性分析，而且样本量较小，Gn刺激时间与IVF结局之间的具体关系尚需要进一步的大样本随机对照研究。

［1］ Bosch E，Ezcurra D.Individualised controlled ovarian stimulation（iCOS）：maximising success rates for assisted reproductive technology patients［J］.Reprod Biol Endocrinol，2011，9：82-91.

［2］ Tan S L，Child T J，Cheung A P，et al.A randomized，doubleblind，multicenter study comparing a starting dose of 100IU or 200IU of recombinant follicle stimulating hormone（Puregonr）in women undergoing controlled ovarian hyperstimulation for IVF treatment［J］.J Assist Reprod Genet，2005，22（2）：81-88.

［3］ Roberts R，Iatropoulou A，Ciantar D，et al.Follicle-stimulating hormone affects metaphase I chromosome alignment and increases aneuploidy in mouse oocytes maturedinvitro［J］.Biol Reprod，2005，72（1）：107-118.

［4］ Pal L，Jindal S，Witt B R，et al.Less is more—Increased gonadotropin use for ovarian stimulation adversely influences clinical pregnancy and live birth following IVF［J］.Fertil Steril，2008，89（6）：1694-1701.

［5］ Li Y，Li Y，Lai Q，et al.Comparison between a GnRH agonist and a GnRH antagonist protocol for the same patient undergoing IVF［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog ［Med Sci］，2008，28（5）：618-620.

［6］ Fernández-Shaw S，Pérez Esturo N，Cercas Duque R，et al.Mild IVF using GnRH agonist long protocol is possible：Comparing stimulations with 100IU vs.150IU recombinant FSH as starting dose［J］.J Assist Reprod Genet，2009，26（2／3）：75-82.

［7］ Al-Inany H，van Gelder P.Success of frozen embryo transfer：Does the type of gonadotropin influence the outcome？［J］.2010，2：89-98.

［8］ Humaidan P，Quartarolo J，Papanikolaou E G.Preventing ovarian hyperstimulation syndrome：guidance for the clinician［J］.Fertil Steril，2010，94（2）：389-400.

［9］ Chen C D，Chen S U，Yang Y S.Prevention and management of ovarian hyperstimulation syndrome［J］.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2012，26（6）：817-827.

［10］ Ye H，Huang G N，Zeng P H，et al.IVF／ICSI outcomes between cycles with luteal estradiol（E2）pre-treatment before GnRH antagonist protocol and standard long GnRH agonist protocol：aprospective and randomized study［J］.J Assist Reprod Genet，2009，26（2／3）：105-111.

［11］ Revelli A，Casano S，Salvagno F，et al.Milder is better？advantages and disadvantages of“mild”ovarian stimulation for humaninvitrofertilization［J］.Reprod Biol Endocrinol，2011，9：25.

［12］ Wei Z，Cheng X，Li H，et al.Effects of prolonging administration gonadotropin on unexpectedly poor ovarian responders undergoinginvitrofertilization［J］.Reprod Biol Endocrinol，2010，8：26-31.

［13］ Detti L，Ambler D R，Yelian F D，et al.Timing and duration of use of GnRH antagonist down-regulation for IVF／ICSI cycles have no impact on oocyte quality or pregnancy outcomes［J］.J Assist Reprod Genet，2008，25 （5）：177-181.

［14］ Elnashar A M，Aboubakr M.Progesterone rise on the day of HCG administration（premature luteinization）in IVF：An overdue update［J］.J Assist Reprod Genet，2010，27（4）：149-155.

［15］ Yanaihara A，Yorimitsu T，Motoyama H，et al.The decrease of serum luteinizing hormone level by agonadotropin-relea-sing hormone antagonist following the mild IVF stimulation protocol for IVF and its clinical outcome［J］.J Assist Reprod Genet，2008，25（4）：115-118.

［16］ Polotsky A J，Daif J L，Jindal S，et al.Serum progesterone on the day of hCG administration predicts clinical pregnancy of sibling frozen embryos［J］.Fertil Steril，2009，92（6）：1880-1885.

［17］ Chen S L，Wu F R，Luo C，et al.Combined analysis of endometrial thickness and pattern in predicting outcome ofinvitrofertilization and embryo transfer：a retrospective cohort study［J］.Reprod Biol Endocrinol，2010，8：30.

［18］ Liu Q，Zhu G，Hu J，et al.Relationship between pronuclear scoring and embryo quality and implantation potential in IVFET［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog［Med Sci］，2008，28（2）：204-206.

［19］ Al-Ghamdi A，Coskun S，Al-Hassan S，et al.The correlation between endometrial thickness and outcome ofinvitrofertilization and embryo transfer （IVF-ET）outcome［J］.Reprod Biol Endocrinol，2008，6：37.

［20］ Fu J，Wang X J，Wang Y W，et al.The influence of early cleavage on embryo developmental potential and IVF／ICSI outcome［J］.J Assist Reprod Genet，2009，26（8）：437-441.

［21］ Kaleli S，Yanikkaya-Demirel G，Erel C T，et al.High rate of aneuploidy in luteinized granulosa cells obtained from follicular fluid in women who underwent controlled ovarian hyperstimulation［J］.Fertil Steril，2005，84（3）：802-804.

［22］ Sibug R M，Helmerhorst F M，Tijssen A M I，et al.Gonadotropin stimulation reduces VEGF120expression in the mouse uterus during the peri-implantation period［J］.Hum Reprod，2002，17（6）：1643-1648.