一种适合本科教学实验的探针标记方法

许本波，谢伶俐，赵福永，田志宏

(长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434025)

自从1975年Edwen Southern提出DNA印渍技术后，分子杂交技术迅猛发展，广泛应用于分子生物学和基因工程的研究。当前，分子杂交技术是分子生物学和基因工程教学、科研中一项最基本的但又非常重要的实验技术，广泛应用于基因表达、转基因检测、分子标记等方面的研究。

分子杂交的主要流程为转膜、探针标记、杂交和显影。其中，转膜过程简单，成本较低。探针有放射性探针和非放射性探针两大类，在早期的研究中，放射性同位素是应用最多的一类探针标记物，其最大的优点是具有较高的特异性和灵敏性，缺点是易造成放射性污染。近年来随着生物技术的不断发展，非同位素标记方法得到了广泛运用。目前探针标记法主要有随机引物延伸法、切刻平移法、末端标记法、PCR法、荧光标记法［1－6］等。虽然有多种探针标记的方法，但都存在或多或少缺点，要么标记效率低，要么标记成本昂贵。但在本科生教学过程中，只能选用安全、简单的探针标记方法，因此常用Dig标记方法。但成本高昂，特别是对于一些地方学校，由于教学经费紧张导致压缩实验规模或简化实验过程，因此迫切需要发展高效、快速、低成本、简捷的实验方法。对于Southern杂交实验，需要开发低成本、简捷和安全的DNA探针标记方法。

目前，最常用的探针标记方法为大肠杆菌Klenow片段随机引物延伸标记法和PCR标记法。前者相对成本较低，但是效率低下，需要的DNA模板量比较大，学生难以掌握。PCR法合成探针效率高、特异性较好，需要的DNA量少，但它也存在价格昂贵、成本较高的缺点，一般一次标记需要250.00元人民币左右。而其昂贵的主要原因之一是探针标记的酶的价格比较高。因此，有人提出了一种利用Taq DNA polymerase进行放射性探针标记的方法［7］，该方法比较适合危险的同位素标记，不适合现在比较公认的比较安全的地高辛标记方法。笔者在基因工程研究和基因工程的教学实践中，从提高安全性，降低实验成本，提高效率的角度，对southern杂交程序中探针标记的方法进行了改进，以求其更好地用于基因工程教学。

1 DNA探针标记方法

1.1 常规的探针标记方法

1)DNA的缺口平移法:

该方法利用DNA聚合酶I将标记的dNTP掺入到新合成的DNA链中，从而合成DNA探针。其基本原理是首先用适当浓度的DNA酶I在DNA探针分子的一条链上打开缺口，缺口处形成3’羟基末端;利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ5’→3外切酶活性，将缺口处5’端核苷酸依次切除;与此同时，在大肠杆菌DNA聚合酶I的5’→3’聚合酶活性的催化下，以另一条DNA链为模板，以dNTP为原料，顺序将dNTP连接到切口的3’羟基上，重新合成一条互补链，从而使缺口沿着互补DNA链移动，原料中含有的标记核苷酸因此替代原DNA分子上的部分核苷酸而掺入到新合成的DNA链中，从而获得标记的DNA探针。此方法的缺点是需要较多的DNA模板(＞200 ng)，且标记效率较低。

2)DNA的随机引物法:

这种方法是使用寡核苷酸随机引物，标记的dNTP和Klenow片段来合成新的标记DNA片段。其主要原料是利用短的随机引物有较大的与模板的结合几率，利用Klenow片段5’→3’聚合酶活性和标记的dNTP来合成新链，从而合成新的标记链。由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记，DNA片段的大小不影响标记的结果。标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入，标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸;单链双链DNA都可作为随机引物标记的模板。但缺点是对DNA纯度要求相对较高，标记效率相对较低。

1.2 改进的探针标记方法及结果分析

1.2.1 探针标记方法

提取质粒DNA，并测量其浓度。参照普通PCR反应体系，配置探针标记的体系，将其中的dNTPs换成Dig标记的dNTPs，具体反应体系见表1。混匀后覆盖1滴矿物油，转到已预热到94℃的PCR仪上进行扩增，扩增程序为:94℃预变性2 min，40个循环包括 94℃变性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环完毕后72℃保温10 min。反应结束后取2 μL PCR产物琼脂糖电泳检测。

表1 探针标记的PCR反应体系

1.2.2 杂交方法

用CTAB法提取甘蓝型油菜基因组 DNA［8］，用限制性内切酶 EcoRI、SacI和 XbaI分别酶切甘蓝型油菜基因组DNA，酶切产物用酚－氯仿法纯化。电泳，转膜，杂交检测按照参考文献［9］和DIG Nucleic Acid Detection Kit说明书进行。

1.2.3 改进方法的结果分析

选用EcoRI、SacI、XbaI酶切甘蓝型油菜基因组DNA(基因中不具这三个酶的酶切位点)，电泳检测发现酶切产物smear重心在4～6 kb之间，表明酶切比较成功(图1)，可以用于下一步实验。

把标记管和对照管产物分别进行电泳，结果发现标记管产物电泳时出现一条大约750 bp的亮带，而对照管产物电泳出现一条大约500 bp的亮带(图2)，符合预测的大小。标记的探针由于在标记的时候掺杂了Dig，电泳检测时导致迁移速率比没有掺杂Dig的对照慢。标记的探针条带电泳比对照慢，表现似一条750 bp条带，表明探针标记成功。

图1 基因组酶切

图2 探针标记

图3 杂交结果

杂交显色后发现 EcoRI、SacI、XbaI的酶切产物和探针杂交后都出现了明亮的条带(如图3所示)，表明用该方法标记的探针可以用于杂交实验。

2 讨论

虽然探针标记的方法有很多种，但都存在种种不足，而且各公司的标记试剂盒都比较昂贵。随机引物延伸法、切刻平移法标记效率相对比较低［10－11］，要求的膜板DNA的量和纯度也比较高，而PCR法标记采用的是专一的标记酶，存在价格高，酶容易失活的缺点。用普通的Taq酶代替标记酶，虽然扩增效率可能没有标记酶好，但由于Taq酶的稳定性比较好，可以通过延长PCR反应过程中的延伸时间，增加循环次数而改良。同时，增加了循环数，可以最大限度地利用Dig Mix，使其完全消耗，从而提高探针的标记效率。

在教学和科学研究中，用普通的Taq酶代替专一的标记酶，得到完全可以用于杂交实验的探针。而且在标记实验中，只需要购买DIG Labeling，其他的都为常规试剂，节省了实验成本，特别适合于教学经费不足但又必须开设的本科生基因工程实验教学。Dig标记无毒，安全性好，PCR方法快速、简便，适合大规模的学生实验。

Taq酶探针标记法相对其他标记方法，具有如下优点:廉价、快速，步骤简便;探针标记效率高，可以用于常规的Southern、Northern及点杂交，而且需要的膜板量少;采用基因特异引物，标记片段特异性高，标记片段大小一致;Taq酶的热稳定性好，不易变性，易于保存。

［1］Feinberg A P，Vogelstein B.A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity ［J］.Analytical Biochemistry，1983，132(1):6－13.

［2］Feinberg A P，Vogelstein B.A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity［J］.Analytical Biochemistry，1984，137(1):266－267.

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