白蚁mtDNA提取方法改良及检测

姜丽红, 邹湘武, 宁涤非, 席在星



白蚁mtDNA提取方法改良及检测

姜丽红*1, 邹湘武1, 宁涤非1, 席在星2

(1. 常德市白蚁防治所, 湖南 常德, 415000; 2. 湖南文理学院 生命科学学院, 湖南 常德, 415000)

利用mtDNA多态性进行种类鉴定是一种分子生物学常用方法, 从DNA水平对白蚁进行物种鉴别并探讨物种的进化, 其必要前提是提取到一定数量和质量的mtDNA. 在分离得到线粒体后, 分别采用CTAB、SDS 2种方法提取mtDNA. 紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度, 用mtDNA 特异性引物进行PCR 扩增检测. 试验证明2种方法均能成功提取白蚁的mtDNA, SDS法提取效果较好.

白蚁; mtDNA提取; CTAB; SDS

白蚁(), 亦称虫尉, 属节肢动物门, 昆虫纲, 等翅目, 属于较低级的半变态昆虫[1]. 白蚁体软而小, 通常长而圆, 白色、淡黄色、赤褐色直至黑褐色. 主要分布于热带和亚热带地区, 以木材或纤维素为食. 全世界已知白蚁种类约3 000余种. 根据黄复生记述, 除了澳白蚁科没有发现外, 中国白蚁隶属4科44属476种[1], 其中散白蚁属种类最多, 超过100种. 白蚁分布范围很广, 约占全国陆地总面积的35%～40%.

线粒体DNA是染色体核外遗传物质, 动物线粒体DNA(mtDNA)为共价闭合环状的双链DNA[2],分子量为15～18 kb, 属于单倍体, 且具有相对自主性, 变异快, 结构相对简单, 经母系遗传, 对真核生物基因组的结构、复制、转录、调控机理等方面都起着重要作用. 近年来被广泛用于近缘种间或种内种群间亲缘关系的研究.

本研究比对分析了用CTAB法和SDS法提取mtDNA技术, 用mtDNA 特异性引物进行PCR 扩增检测, 以期找到提取白蚁mtDNA最佳方法.

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

饱和酚、氯仿、EDTA、Tris、CTAB、SDS、琼脂糖, 引物由生工生物工程有限公司合成, PCR试剂盒, 紫外分光光度计, PCR仪, 电泳仪, 凝胶成像分析系统.

1.2 样本

白蚁标本采集于常德市河洑森林公园、德山公园. 采回后存放于-80 ℃冰箱备用.

1.3 线粒体的获取

a. 取10头新采集的白蚁, 去腹部, 于1.5 mL Eppendor管中加液氮研磨, 再转入玻璃匀浆器加1 mL冷匀浆液匀浆, 随即以3 000 rpm、4℃离心3 min[2]; b. 取上清, 10 000 rpm, 4 ℃离心10 min, 沉淀即为粗线粒体.

1.4 mtDNA 的提取

1.4.1 CTAB法

a. 取粗线粒体移入1.5 mL Eppendorf管中; b. 加入800 μL 65 ℃预热的CTAB提取缓冲液, 混匀, 每5 min轻轻震荡几次, 20 min后12 000 rpm离心15 min; c. 小心吸取上清液, 加入等体积的酚和氯仿(各400 μL)溶液, 混匀, 4 ℃、12 000 rpm离心10 min; d. 小心吸取上清液, 加入等体积的氯仿, 混匀, 4 ℃、12 000 rpm离心10 min; e. 重复步骤d 1～2次, 以蛋白层不出现为止; f. 取上清,-20 ℃沉淀1 h, 4 ℃、12 000 rpm离心10 min; g. 弃去上清液, 用70%乙醇洗涤沉淀2次; h. 室温下干燥后(一般干燥30 min), 溶于30～50 μL去离子水中, 于－20 ℃下保存备用[3].

1.4.2 SDS法

a. 将线粒体溶于100 mL(50 mmol/l葡萄糖、10 mmol/L Na2EDTA、25 mmol/L Tris-HCl, pH8.0)溶液中, 充分混匀; b. 加200 ml新鲜配制的(1%SDS, 0.2 N NaOH)溶液, 轻轻摇匀, 冰浴5 min[4]; c. 再加150 mL 3 M NaAc(pH4.8)溶液, 轻轻摇匀, 冰浴5 min, 12 000 rpm离心10 min; d. 取上清加等体积酚、氯仿、异戊醇(体积比为25:24:1)溶液, 抽提2～4次, 界面无白色物质, 12 000 rpm离心10 min; e. 取上清加2倍体积95%乙醇, 室温静置15 min, 然后12 000 rpm离心10 min; f. 弃上清, 沉淀用75%乙醇洗涤1次, 以12 000 rpm离心5 min; g. 弃上清, 取沉淀, 真空干燥后得线粒体DNA. 将其溶于适量的TE缓冲液中, －20 ℃保存备用[5].

1.5 DNA浓度和纯度检测

使用紫外分光光度计检测. 用100 μL TE 溶液作空白对照, 取所提取的mtDNA 1 μL 加入99 μL TE 中, 检测样本不同波长的光密度值(OD), 并计算OD260/OD280值和质量浓度.

1.6 凝胶电泳检测

1.0%琼脂糖凝胶, 5 μLmtDNA 样品混合1 μL溴酚蓝, 5 V/cm电泳40 min, 置于凝胶成像分析系统观察并拍照.

1.7 16 S rRNA gene部分序列PCR扩增

1.7.1 引物

采用Husseneder C等[6]设计的白蚁mtDNA 16S rRNA gene引物序列进行PCR 扩增, 其上游引物 5’-TTACGCTGTTATCCCTAA-3’, 下游引物 5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’.

1.7.2 PCR扩增体系及程序

按表1和图1进行PCR扩增.

表1 PCR体系 /μL

图1 PCR扩增程序

2 结果与分析

2.1 DNA纯度检测及分析

在紫外分光光度计下检测mtDNA的纯度和浓度, 检测结果见表2. 测定结果表明OD260/OD280的光吸收比值均在1.7～2.0之间, 说明无蛋白质和酚的污染, 符合PCR的要求[2]. 从表2可知, SDS法提取白蚁mtDNA纯度和浓度都明显高于CTAB法. 经纯化后, OD260/OD280都达到了1.85以上, 完全符合RLFP的要求[7].

表2 紫外分光光度计检测结果

2.2 电泳检测结果及分析

取5 μLmtDNA 样品混合1 μL溴酚蓝, 0.8%琼脂糖凝胶80 V电泳40 min, 电泳图见图2. 4条泳道都能看到mtDNA, 大小在17 kb左右, 与邢连喜[6]等研究的散白蚁mtDNA分子量结果基本相吻合. 泳道上方还有一条带, 大小在40 kb左右, 应该为总DNA. 其中泳道1和2是CTAB法电泳结果, 条带较暗; 泳道3和4是SDS法电泳结果, 条带明亮. 由图2可知, SDS法提取的DNA丰度较大, 且蛋白质和酚类物质较少; 而CTAB法提取的DNA量较少, 有蛋白质和酚类物质污染, 故用SDS法提取较优.

图2 mtDNA电泳图. 1—CTAB法; 2— CTAB 法纯化后; 3— SDS法; 4— SDS法纯化后

图3 PCR结果电泳图

2.3 PCR检测结果及分析

对2种不同提取方法得到的白蚁mtDNA 对其16 S rRNA gene进行PCR扩增, 电泳结果如图3. 由图3可知, 2种不同提取方法得到的白蚁mtDNA都能得到430 bp左右的条带, 与张卫东等研究的6种乳白蚁的16 S rRNA序列长度结果基本相吻合[8], 证明提取结果正确.

3 小结与讨论

不同物种其核酸提取方法各不相同. CTAB是一种阳离子去污剂, 具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性. 其特点是去除多糖和酚类物质的效果较好, 故常用于植物核酸的提取, 但因此核酸也有部分损失, 其提取的丰度较少. 而SDS是一种阴离子去污剂, 易与疏水性较强的蛋白质结合而沉淀, 故常用于动物核酸的提取. 因此, SDS法更适合提取白蚁mtDNA.

本文就白蚁mtDNA 的提取技术在前人的基础上进行了改良, 主要体现在提取之前的线粒体分离处理、粗提后的纯化和PCR鉴定. 线粒体的分离保证了提取的mtDNA不受白蚁体内寄生虫DNA的污染, 其结果更加真实可靠; PCR鉴定是通过特异引物对16 S rRNA gene的扩增, 本研究提取的mtDNA能扩增出16 S rRNA gene, 表明了提取的结果是正确的; 粗提后的纯化保证了mtDNA纯度, 蛋白质和酚类物质污染很少, 能满足RLFP的要求.

[1] 黄复生, 朱世模, 平正明. 中国动物志昆虫纲第十七卷等翅目[M]. 北京: 科学技术出版社, 2000: 3—5.

[2] 朱玉贤, 李毅．现代分子生物学[M]. 2版. 北京: 高等教育出版, 2000: 127—139.

[3] 王文, 施立明. 一种改进的线粒体DNA提取方法[J]. 动物学研究, 1993, 14(2): 197—198.

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[6] Husseneder C, Messenger M T, Su N Y, et a1. Colony social organization and population genetic structure of an introd- uceeed population of Forman subterranean termite from New Orleans, Louisiana[J]. Apieuhure and Social Insects, 2005, 98(5): 1424—1434．

[7] 徐刘平, 梁小松, 周秋君, 等. 分子生物学技术在白蚁种群分类中的应用[J]. 验检疫学刊, 2009, 19(4): 70—74.

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Improvement and Check on the mtDNA extract techniques for termites

JIANG Li-hong1, ZOU Xiang-wu1, NING Di-fei1, XI Zai-xing2

(1. Termite Control Institue of Changde, Changde 415000, China; 2. College of Life Sciences, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

Species identification with mtDNA polymorphisms is an usual method in molecular biology. To identify the species and to explore the evolution of the termites from the DNA level, it is necessary to extract the mtDNA with enough quantity and good quality. In this study, mitochondria of termites is firstly isolated, then CTAB and SDS methods were employed for the extraction of mtDNA, respectively. Purity and concentration of mtDNA were determined by UV spectrophotometer. PCR amplification of mtDNA was executed by specific primers. Results shows that both CTAB the SDS methods can successfully extracted termite mtDNA, but SDS method shows better performance than CTAB method.

termites; mtDNA extract; CTAB; SDS

10.3969/j.issn.1672-6146.2013.01.007

Q 969.29+6

1672-6146(2013)01-0028-03

email:120087902@qq.com.

2013-01-03

湖南省自然科学基金项目(02JJY2055)

(责任编校:刘刚毅)