大鼠肝纤维化分期的流变特性分析

朱 颖，沈圆圆，陈 昕，林浩铭，汪天富，陈思平

医学超声关键技术国家地方联合工程实验室，广东省生物医学信息检测与超声成像重点实验室，深圳大学医学院，深圳 518060

大鼠肝纤维化分期的流变特性分析

朱 颖，沈圆圆，陈 昕，林浩铭，汪天富，陈思平

医学超声关键技术国家地方联合工程实验室，广东省生物医学信息检测与超声成像重点实验室，深圳大学医学院，深圳 518060

指出肝脏纤维化会导致生物组织的力学属性发生改变，按照纤维化分期对大鼠肝脏组织进行流变力学实验.用Zener和Voigt两类黏弹性模型解释实验得到的剪切模量.结果表明，Zener模型比Voigt模型能更好地描述大鼠肝纤维化各分期的组织流变特性，尤其是Zener模型的弹性系数E2从F1到F2期有显著改变.研究还发现E2值可视为区分纤维化轻度 (F1期)以下、中度 (F2期)以上的分水岭，这一发现为肝脏黏弹性与纤维化分级的理论研究提供了新思路.

生物力学;肝纤维化;流变力学;Zener模型;Voigt模型;弹性系数;黏性系数;剪切模量;大鼠肝脏

肝纤维化是危害人类健康的常见病之一.METAVIR评分系统把肝纤维化分为4级，其中，F0为无纤维化;F1为门静脉旁纤维化不伴分隔;F2为门脉旁纤维化伴少量分隔;F3为大量分隔不伴肝硬化;F4为肝硬化［1］.在临床诊断上，F1和F2期属于轻、中度肝纤维化阶段，一般认为，此阶段肝纤维化经治疗能逆转恢复健康.从生物力学的角度来说，组织质地变化意味着其力学特性的改变，冯元桢等［2］发现黏弹性 (viscoelasticity)是反映人体软组织力学特性的最佳指标.黏弹性参数的定量获得依赖于解释软组织对象所用的流变模型.文献［3-8］采用生物力学手段对动物正常软组织的流变特性及黏弹性属性进行研究，正常肝脏组织无病变，质地均匀，通常采用Voigt模型描述其流变特性，该模型由一个弹簧和一个黏壶并联而成.问题在于，由于肝脏组织发生病理改变，组织软硬度分布不均，Voigt模型是否能描述肝纤维化组织的流变特性?迄今尚无报道.为此，本研究采用流变学法，探讨适合描述大鼠肝纤维化分期的肝脏组织流变模型，通过定量获取各分期肝脏的黏弹性属性值，研究黏弹性属性与纤维化分期的关系.

1 原理与方法

1.1 实验原理

生物组织流变力学测量是对软组织施加正弦应变 (strain)观察其相应的应力 (stress)响应，定义应力与应变的比值为软组织的复模量G*(ω)，

常用软组织流变模型Voigt模型是由弹簧E1和黏壶η并联而成，如图1.Voigt模型的复模量定义为(ω)=E1+iωη，其中，E1为弹性系数 (elasticity);η为黏性系数 (viscosity).Voigt模型的复模量的模定义为

图1 Voigt流变模型Fig.1 Voigt rheological model

图2 Zener流变模型Fig.2 Zener rheological model

另一种流变模型Zener模型由弹簧E2和黏壶η串联，再与弹簧E1并联而成，如图2.Zener模型的复模量定义为

其中，E1和E2为弹性系数;η为黏性系数.Zener模型的复模量的模定义为

通过判定系数R2判断模型的拟合优度

1.2 动物模型

本实验采用雄性SD(Sprague Dawley)大鼠24只，体重在180～270 g(由广东省医学实验动物中心提供)，其中模型组 (F1、F2、F3和F4期)18只，对照组 (F0期)6只.模型组的培养按每100 g体质量0.3 mL皮下注射CCl4和橄榄油混合液(体积比为1∶1)，首次剂量加倍，2次/周.分别于2、5、9和13周后得到不同肝纤维化程度的大鼠.由于肝脏纤维化造模的成功与否，受培养方法和大鼠个体对药物承受能力及肝脏自我修复能力的影响，肝纤维化分级与造模培养时间并不完全成正比.每只大鼠的纤维化分期通过病理切片和Masson三色染色检查鉴定，这样，模型组大鼠肝纤维化分期结果为F1期5只、F2期8只、F3期4只、F4期1只.实验顺序按照F0～F4分期进行.将大鼠麻醉实行安乐死后，用手术刀片和直径25 mm的圆形空心模子在肝脏上钻取样品组织 (样品块数视肝脏大小而定，每只大鼠可获得1～2块肝脏样品)，并用手术小剪刀修正样品的表面及边缘，使其厚度均匀 (约 (4±1)mm)和边缘光滑.因此实际的肝脏样品数量为F0期6块，F1期5块，F2期9块，F3期5块，F4期2块.流变学实验所用仪器为美国TA旋转流变仪AR1000系列，其上下平行板直径为25 mm.实验时，首先进行应变扫描测试 (strain sweep test)，应变扫描范围0.01% ～2%，分别在1 Hz和40 Hz振动频率下进行.接着，进行频率扫描测试 (frequency sweep test)，应变控制在0.5%，频率扫描范围从 1～40 Hz，从而得到样品的实验数据，分别用Zener模型和Voigt模型进行拟合.

图3 肝纤维化分期的实测(星花)和拟合(实线)结果Fig.3 The experimental data(asterisks)and simulated results(solid lines)for each fibrosis stage

2 结果与讨论

2.1 实验结果

随机选取每个分期的1块样品，共5个分期.根据Levenberg-Marquardt非线性最小二乘算法，分别利用式(2)和式(3)拟合实验结果，如图3.由图3可见，各分期测量值随频率增加和纤维化程度加强而逐渐上升，说明肝脏的流变特性在纤维化过程中发生了明显变化.

2.2 肝纤维化分期流变特性分析

根据两种模型分别计算出各分期所有样品的黏弹性参数值 (表1).从表1可见，在F0和F1期，Zener模型的弹性系数E1的数值均在几百帕左右，数量级为102，而弹性系数E2的数值除982.17 Pa和1 378.90 Pa两值外 (考虑到实验各项因素累积误差)，其余均达到了105～107的数量级;有趣的是，Voigt模型的E1和η与Zener模型的E1和η的数值非常接近，从而证实了本研究的推测:由于F0和F1期的弹性系数E2≫E1，Zener模型的近似于Voigt模型.因此，在F0和F1期，两种模型推算出的肝脏弹性系数E1和黏性系数η是非常近似的.在F2、F3和F4期，Zener模型的弹性系数E1发生了变化，总体上大于F0和F1期的E1值，且数量级上升到103，而弹性系数E2的数量级从F0和F1期的105～107下降到102.这也证实了本研究的推断:从F2期开始，肝脏弹性系数E1和E2之间的数量级发生了变化，E1数量级有所增加，E2数量级下降幅度明显.对于黏性系数η，F0期的黏性值变化较小，这是由于正常期的肝脏组织无病变，质地较均匀;而F1～F4期的黏性值总体上较F0期有所增加，由于各期样品之间的个体差异，纤维化病变区域分布不均，导致了各期样品的黏性值差异较大.

表1 大鼠肝纤维化分期黏弹性系数值Table1 The viscoelasticity parameters of each fibrosis stage according to the models

图4 各分期肝纤维化样品的实验结果平均值Fig.4 Mean values of experimental data of the specimens for each fibrosis stage

图4为各纤维化分期样品的实验数据平均值(n为样本个数).由图4(a)和图4(b)可见，两种模型在F0期和F1期的拟合曲线几乎是一致的，而在F2、F3和F4期 (图4(c)～图4(e))，Zener模型的拟合效果优于Voigt模型.

两种模型拟合效果的优劣可通过计算判定系数R2的数值具体表现出来，见表2.R2越接近1，表明拟合效果越好.在F0和F1期，两种模型的R2值相等，而在F2、F3和F4期，Zener模型的R2值远大于Voigt模型的R2值.由于F0期 (正常)肝脏组织质地均匀且无病变，因此F0期实验结果的误差条是最短的 (图4(a));随着纤维化程度加深，肝脏的病理结构发生变化，病变区域分布不均，黏弹性随之发生改变，导致F1～F4期的个体实验结果之间差异较大 (图4(b)～图4(e)).

表2 两种模型拟合结果的判定系数R2值Table 2 The coefficient of determination R2of the fitting results of the two models

结 语

本研究对大鼠肝纤维化分期的流变力学特性进行了研究，通过实验获得了各分期大鼠肝脏样品的复剪切模量值，由此分析了肝脏随分期改变的流变力学特性并利用两种不同的流变模型计算出肝脏的黏弹性参数.结果表明，Zener模型较Voigt模型更适合描述大鼠肝纤维化分期的流变特性，Zener模型的弹性系数E2在F1期以前和F2期以后表现出明显的数量级差别.然而，Voigt模型由于缺少一个弹性系数，因此不能反映出该数量级特征.弹性系数E2值可视作区分肝纤维化轻度 (F1)以下和中度 (F2)以上的标志.本研究的初始动机是用超声弹性成像技术［9-12］对大鼠肝纤维化进行研究.Voigt模型是超声弹性成像技术中使用的传统流变模型，但是其局限于正常软组织的流变特性的描述.本研究填补了动物肝纤维化分期的流变模型及其黏弹性特性研究的空白，同时给目前以Voigt模型为传统理论模型的超声弹性成像技术，提供了新思路.

/References:

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［4］Klatt D，Friedrich C，Korth Y，et al.Viscoelastic properties of liver measured by oscillatory rheometry and multifrequency magnetic resonance elastography［J］.Biorheology，2010(47):133-141.

［5］ Miklos Z Kiss，Tomy Varghese，Timothy J Hall.Viscoelasticity characterization of in vitro canine tissue ［J］.Physics in Medicine and Biology，2004，49(18):4207-4218.

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2012-09-14;

2013-03-12

Rheological properties analysis of rats liver in fibrosis stages

Zhu Ying，Shen Yuanyuan，Chen Xin，Lin Haoming，Wang Tianfu，and Chen Siping†

National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound，Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging，School of Medicine，Shenzhen University，Shenzhen 518060，P.R.China

The process of liver fibrosis changes the rheological properties of tissue.This study characterized and compared liver fibrosis stages from F0 to F4 of rats using rheological mechanics experiments.Two viscoelasticity models—Voigt model and Zener model were applied to explaining the experimental data.The experiment results indicate that Zener model is preferred to Voigt model for describing rheological properties of each stage of liver fibrosis of rats，especially for describing the order of magnitudes of the elasticityE2of Zener model declining significantly from stage F1 to F2.The study indicate that the elasticityE2can be regarded as a watershed of mild fibrosis(≤F1)and moderate fibrosis(≥F2)，hence providing a new idea for the research of the relationship of liver.

biological mechanics;liver fibrosis;rheological mechanics;Zener model;Voigt model;elasticity;viscosity;shear modulus;rat liver

R 318.01;Q 66;R 333.4

A

10.3724/SP.J.1249.2013.02216

Foundation:National Natural Science Foundation of China(61031003，81101171)

†

Professor Chen Siping.E-mail:chensiping@szu.edu.cn

:Zhu Ying，Shen Yuanyuan，Chen Xin，et al.Rheological properties analysis of rats liver in fibrosis stages ［J］.Journal of Shenzhen University Science and Engineering，2013，30(2):216-220.(in Chinese)

国家自然科学基金资助项目 (61031003，81101171)

朱 颖 (1980-)，女 (汉族)，江西省彭泽县人，深圳大学博士研究生.E-mail:jgwenzying@yahoo.com.cn

引 文:朱 颖，沈圆圆，陈 昕，等.大鼠肝纤维化分期的流变特性分析［J］.深圳大学学报理工版，2013，30(2):216-220.

【中文责编:晨 兮;英文责编:艾 琳】