高迁移率族蛋白1在慢性牙周炎病变牙龈组织中的表达

赵华强　穆萍萍　魏玲玲　侯萌　孙钦峰　宋晖　杨丕山

[摘要] 目的 研究慢性牙周炎病变牙龈组织中高迁移率族蛋白1（HMGB1）的表达。方法 提取健康志愿者外周血单核细胞（PBMC），以1 μg·mL-1的细菌脂多糖（LPS）刺激细胞，24 h后用免疫荧光染色法检测HMGB1的表达，48 h后用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中HMGB1的表达；分别以50 ng·mL-1肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和100 ng·mL-1

HMGB1刺激PBMC，48 h后检测细胞上清液中HMGB1和TNF-α的表达。另外收集健康者和慢性牙周炎患者的牙龈组织和龈沟液，分别检测牙龈组织和龈沟液内HMGB1的表达。结果 LPS刺激PBMC 24 h后，HMGB1自细胞核移出至细胞质中；刺激48 h后，细胞上清液中HMGB1的表达量明显高于对照组（P<0.01）。TNF-α和HMGB1分别刺激

PBMC 48 h后，上清液中HMGB1和TNF-α的表达水平较对照组亦有明显增强（P<0.01）。在慢性牙周炎牙龈组织上

皮钉突下方浸润的细胞中，HMGB1自细胞核转移至细胞质和细胞外；其龈沟液内HMGB1的表达量也明显高于健康对照组（P<0.01）。结论 HMGB1可能在牙周炎病理进程中有重要作用。

[关键词] 高迁移率族蛋白； 牙周炎； 龈沟液； 外周血单核细胞

[中图分类号] R 781.4 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.019

慢性牙周炎在发生发展过程中，牙周致病菌及其产物脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可激活宿主的免疫系统，导致大量免疫活性细胞浸润和多种炎症介质释放，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，

TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）

等。高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，

HMGB1）是存在于真核生物细胞内高度保守的一类

含量丰富的非组蛋白染色体结合蛋白。研究[1]发现：细胞内HMGB1可通过活化细胞的主动分泌，或通过坏死、受损细胞的被动释放进入细胞外，诱导下游其他炎症因子的产生，而这又会导致更多的HMGB1释放[2]。由此可见，HMGB1是一种重要的晚期致炎

因子，对于炎症的进程和预后有着重要的作用，较TNF-α、IL-1β等早期速发型炎症因子具有更重要的临床意义。目前，已发现HMGB1在胰腺炎[3]、败

血症[4-5]等感染性疾病中具有重要作用，但在牙周炎病变组织中的表达情况还少有研究。

本研究采集人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）建立体外实验模型，研究

LPS刺激下细胞HMGB1的释放情况及HMGB1与炎症因子TNF-α之间的相互关系；另外，收集慢性牙周炎患者的病变牙龈组织和龈沟液，采用免疫组织化学染色和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immuno-

sorbent assay，ELISA）研究病变组织中HMGB1的表达情况，探讨其在牙周炎病程中的变化和可能作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

兔抗HMGB1多克隆抗体（Biomol公司，美国），

德克萨斯红耦联羊抗兔IgG（Molecular Probes公司，

荷兰），HMGB1和TNF-α的ELISA试剂盒（R&D;公司，美国）；Multiskan MK3型酶联免疫分光光度仪（Ther-

mo Labsystems公司，芬兰），共聚焦显微镜（Leica TCS SP2型，Leica Microsystems公司，德国），BX51型荧光显微镜（Olympus公司，日本）；Triton X-100，

大肠杆菌LPS（Sigma公司，美国），HMGB1（Abcam

公司，英国）。

1.2 人PBMC的提取

新鲜外周血取自1名健康志愿者（男性，24岁）。抽取外周静脉血20 mL加入PBS溶液，吹打混匀。在50 mL Falcon离心管中加入15 mL Ficoll PaqueTM plus（Amersham Biosciences公司，瑞典），在其上加入血液和PBS的混合液，然后将离心管在20 ℃、400 g条件下离心40 min。离心后，将中间相液体取出，转移至新的离心管中，加入PBS再离心10 min。弃掉上清液，加入含有NH4Cl和KHCO3的eryshock溶液，置于冰上10 min以去除红细胞，其后将细胞经冲洗和离心后，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养。

1.3 样本收集

收集2009—2010年于山东大学口腔医院牙周病科因慢性牙周炎行牙龈翻瓣手术的6例患者术中切除的病变牙龈组织作为试验组，同期收集于山东大学口腔医院口腔颌面外科行埋伏牙拔除术的4例患者所切除的健康牙龈组织标本作为健康对照组。6例牙周炎患者男性3例，女性3例；年龄48～70岁，平均（56.0±8.5）岁；术区牙齿平均探诊深度为（6.63±

2.12） mm，平均附着丧失水平为（6.89±2.17） mm；

均已行牙周基础治疗。4例对照组患者中，男女各2例，年龄23～32岁，平均（26±7.8）岁。所有患者均于术前告之手术及取样情况，并征得其同意。

1.4 免疫组织化学染色

提取的人PBMC加入1 μg·mL-1的LPS，以未加入LPS的PBMC作为对照。静置24 h后，分别收集细胞滴于载玻片上，离心后以4%甲醛溶液常温固定细胞1 h，加入0.5% Triton X-100进行透化作用，5 min后以含有2%胎牛血清白蛋白的缓冲液阻断非特异反应，加入抗HMGB1抗体（1∶50）4 ℃下孵育过夜。反复冲

洗后加入德克萨斯红耦联的羊抗兔IgG（1∶200）常温

孵育1 h，冲洗后封片，使用含有4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的封片液以显示细胞核，荧光显微镜下观察。切取的牙龈组织以4%甲醛溶液常温固定1 h后以石蜡包埋。部分牙龈组织进行常规苏木精-伊红（hematine-eosin，

HE）染色；部分牙龈组织经脱蜡和乙醇梯度脱水后，以0.1 mol·L-1 C6H10O8和0.2 mol·L-1 Na2HPO4·2H2O进行抗原修复。抗原修复后行常规免疫组织化学染色。以含2%胎牛血清白蛋白的缓冲液阻断非特异反应，然后加入抗HMGB1抗体（1∶50）4 ℃下孵育过夜，反复冲洗后加入德克萨斯红耦联的羊抗兔IgG（1∶200）常温孵育1 h，反复冲洗后封片。共聚焦显微镜下观察。

1.5 ELISA

人PBMC加入10 μg·mL-1的LPS，以未加入LPS的细胞作为对照。静置48 h后，检测上清液中HMGB1的表达。分别以50 ng·mL-1 TNF-α和100 ng·mL-1 HMGB1刺激PBMC，48 h后检测上清液中HMGB1和TNF-α的水平。按照HMGB1和TNF-α ELISA试剂盒说明要求进行检测。在试验组患者进行牙周手术前，选择术区牙周探诊深度最深的2颗患牙，每颗牙选择4个

位点（颊舌侧近中和远中）以自制滤纸条收集患者的龈沟液。合并每颗牙同侧2个位点的龈沟液样本，稀释后按照HMGB1 ELISA试剂盒说明检测龈沟液中HMGB1的含量。收集牙龈健康对照组患者相应牙齿的龈沟液作为对照。

1.6 统计学分析

采用SPSS 11.0软件包进行统计学分析，统计方法为t检验，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 人PBMC在LPS刺激下HMGB1释放情况

正常情况下，人PBMC的HMGB1位于细胞核内，如图1A所示：红色染色（德克萨斯红）的HMGB1位于蓝色染色（DAPI）的细胞核内。以1 μg·mL-1的LPS刺激PBMC 24 h后，细胞核内的HMGB1转移至细胞质内，表现为红染的HMGB1移出细胞核转移至细胞质中（图1B中箭头所示）。

PBMC经1 μg·mL-1的LPS刺激48 h后，收集细胞上清液行ELISA检测，结果发现：未经LPS刺激的PBMC上清液中HMGB1表达量为（97.2±8.5） ng，经

LPS刺激后的表达量为（756.2±18.5） ng，二者差异有统计学意义（P<0.01）。该结果表明，经LPS刺激后，PBMC上清液中的HMGB1表达量明显升高，提示细胞质中的HMGB1释放至细胞外。

2.2 HMGB1与TNF-α表达的关系

以50 ng·mL-1的TNF-α刺激PBMC 48 h后，收集细胞上清液，用ELISA法检测HMGB1表达水平，结果可见：TNF-α刺激后，PBMC上清液中的HMGB1表达量为（1 258.3±98.6） ng，较未受刺激时的（119.4±12.6） ng明显增强（P<0.01）。以100 ng·mL-1的HMGB1刺激PBMC 48 h后，上清液中TNF-α表达量为（1 320.8±

91.6） ng，较未受刺激时的（103.9±20.5） ng明显增强（P<0.01）。该结果提示：HMGB1可诱导TNF-α的产生，而TNF-α的产生也会导致HMGB1的释放。

2.3 牙周炎患者病变牙龈组织中HMGB1的表达

牙周炎组和健康对照组牙龈组织的HE和免疫组织化学染色结果如图2所示。与健康对照组牙龈组织（图2左上）相比，牙周炎组牙龈组织（图2右上）上皮钉突下方可见有大量白细胞浸润及胶原组织破坏。由于牙周炎局部病变组织中浸润的单核巨噬细胞被视为HMGB1的重要来源，本研究着重展示了上皮钉突下方细胞HMGB1的表达情况：健康对照组牙龈组织上皮钉突下方可见到HMGB1主要位于细胞核中（图2左下）；而在牙周炎组牙龈组织中，HMGB1则表现为自细胞核转移至细胞质中或至细胞外，可见淡染空虚的细胞核和核周及细胞间的红染区域（图2右下，箭头示）。

2.4 牙周炎患者龈沟液中HMGB1的表达

牙周炎组和健康对照组龈沟液中HMGB1的表达量分别为（39.8±1.1） ng和（32.1±3.5） ng，二者差异有统计学意义（P<0.01），牙周炎组明显高于健康对照组。

3 讨论

HMGB1是在20世纪60年代发现的高度保守的非组蛋白染色质蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移能力而得名[6]。HMGB1广泛分布于淋巴组

织、脑、肝、肺、心、脾、肾等组织中，在肝、脑组织中主要存在于细胞质，而在其他多数组织中则存在于细胞核[7]。在炎症等病理条件下，细胞核中

的HMGB1会转移至细胞质中，继而释放至细胞外。

HMGB1的功能因其所处的位置而不同。位于细胞核内时，主要功能是稳定核小体构象和调节基因转录；释放到细胞外后，则作为炎症细胞因子在炎症免疫反应中具有重要作用。

HMGB1通过两种途径释放到细胞外。一是被动释放，由于HMGB1和染色体的结合不如核蛋白牢固，细胞坏死时HMGB1和染色体解离释放至细胞外；二是主动释放，在激活的细胞中，如单核巨噬细胞，HMGB1由细胞核移至细胞质，然后进入溶酶体，通过胞吐作用分泌至细胞外。在移位的过程中，HMGB1被磷酸化。研究[8-10]表明，HMGB1的释放是通过其

与细胞表面的糖基化终末产物受体（receptor for ad-

vanced glycation end-products，RAGE）和Toll样受体（toll-like receptor，TLR）-2、TLR-4的结合来实现的。在多种炎症免疫性疾病，如风湿性关节炎[11]和

系统性红斑狼疮[12]]，均可见到HMGB1自细胞核移位的情况。细胞外的HMGB1已被证实在这些疾病的病理进程中具有重要作用。

本研究采用免疫组织化学和ELISA技术，证实了在细菌LPS的刺激下，人PBMC中的HMGB1首先自细胞核移位至细胞质中，继而释放至细胞外；此外，本研究还发现，HMGB1可以诱导牙周炎重要炎症因子TNF-α的产生，而TNF-α的产生又会导致HMGB1的释放。在这一炎症增强放大环路中，HMGB1具有重要作用。在慢性牙周炎患者的病变牙龈组织中，同样可以见到HMGB1自细胞核移位至细胞质，甚至到细胞外的情况；牙周炎病变牙齿的龈沟液内HMGB1的含量明显高于正常牙齿。这些结果均提示细胞外的HMGB1作为一种晚期炎症因子，可能在牙周炎的病理进程中起作用。

尽管多种细胞，如血管内皮细胞[13]、上皮细胞[14]、单核巨噬细胞[1]等，均已被发现可在炎症环境中释放

HMGB1，但单核巨噬细胞仍被认为是细胞外HMGB1的主要来源。慢性牙周炎的主要病理特点是局部病变区域中大量免疫活性细胞如粒细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞等的迁移和浸润。这些局部浸润的免疫活性细胞在细菌及其LPS的作用下，可分泌大量炎症因子，当然这些浸润的细胞同样会成为HMGB1的来源。在慢性牙周炎的牙龈组织中，可以见到上皮钉突下方大量白细胞浸润，这些细胞的HMGB1已由细胞核转移至细胞质甚至细胞外。与健康牙龈相比，慢性牙周炎患者龈沟液的HMGB1表达量也明显升高。这些结果显示：HMGB1是一种具有较高活动性的蛋白质，在炎症环境下，可以自细胞核穿梭至细胞质并最终释放至龈沟液内。

牙周炎是危害口腔健康的主要疾病之一，尽管目前对其病因和病理发生机制有了进一步的认识，多种炎症因子在其发展进程中的作用亦得到较广泛的研究，然而目前尚无有效的治疗手段。本研究结果显示：人PBMC在细菌LPS的刺激下可以释放HMGB1，且HMGB1可与TNF-α形成增强放大环路，加速炎症反应进程。在慢性牙周炎局部组织大量浸润的单核巨噬细胞中，HMGB1自细胞核移位至细胞质中，甚至细胞外，并最终释放至龈沟液内。HMGB1可能在慢性牙周炎的病理进程中具有重要作用，探讨HMGB1的作用将为牙周炎的治疗提供新的思路。

致谢：感谢德国海德堡大学曼海姆医院Benito Yard教授的大力帮助，本研究中牙龈组织切片的免疫组织化学染色在海德堡大学曼海姆医院实验中心完成。

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（本文编辑 吴爱华）