人β防御素—4在牙龈组织表达的新发现

李欣忆　段丁瑜　王盼盼　韩波　徐屹

[摘要] 目的 探讨牙龈组织中是否存在β防御素-4（hBD-4）及其分布情况。方法 收集健康牙龈标本。采用免

疫组织化学法检测18例牙龈组织标本hBD-4蛋白水平的分布；提取组织RNA，进行实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real time RT-PCR）检测30例牙龈标本中hBD-4基因的表达水平。结果 免疫组织化学检测结果显示，18例牙龈样本中有13例检出hBD-4；real time RT-PCR检测结果显示，30例牙龈组织中4例样本检测出hBD-4表达。结论 hBD-4在健康牙龈组织中有不同水平的表达和分布，可能在维持牙周组织健康中起作用。

[关键词] 牙龈； 人β防御素-4； 免疫组织化学； 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应

[中图分类号] Q 26 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.013

防御素是一族富含半胱氨酸残基的阳离子短肽，根据6个半胱氨酸残基的位置和连接差异，人防御素可以分为α防御素和β防御素（human β defensin，

hBD）[1]。其中，hBD由哺乳动物单核细胞/巨噬细胞、上皮细胞等产生，主要分布在脊椎动物的皮肤、黏膜等上皮组织，在机体宿主-环境的界面位置，构成机体非特异性天然免疫系统中抵御外界伤害刺激的第一道生化屏障。hBD通过直接杀灭和/或使细菌、真菌及病毒等病原因子某部分失活，阻止病原菌入侵[2]；还可能调节获得性免疫的重要信号分子，对

单核细胞、T细胞等具有选择性趋化作用[3]，从而加速免疫和伤口愈合过程，对炎症起调节作用。

迄今发现4种人hBD，分别为hBD-1、hBD-2、hBD-3、hBD-4，可在呼吸道上皮、牙龈上皮、泌尿生殖器上皮、鼻黏膜、眼内组织、毛细血管内皮细胞、肠上皮、前列腺上皮[4-5]等组织中被检出。已有大量学者报道了hBD-1、hBD-2、hBD-3在牙龈上皮内的表达情况。Vardar-Sengul等[6]检测牙龈组织

中hBD-1的mRNA表达水平，结果发现，hBD-1在龈炎和侵袭性牙周炎组表达较低，在慢性牙周炎组的表达显著高于健康对照组。张旭等[7]采用免疫组化

的方法检测11例健康人、18例慢性牙周炎患者、9例侵袭性牙周炎患者牙龈组织中hBD-2的表达。结果显示，健康组hBD-2的表达水平显著高于慢性牙周炎组。但是，其他组间未见显著性差异。Lu等[8]

检测慢性牙周炎和健康人牙龈组织中hBD-3的表达，结果显示，88%的样本可检测到hBD-3。

hBD-4与其他防御素不同，该防御素在某些上皮中选择性表达，已有研究证实：在中性粒细胞、甲状腺、肺、子宫、肾上皮细胞中存在hBD-4[9]。hBD-4在下呼吸道感染的先天性免疫中起重要作用，能特异性抑制大肠杆菌和铜绿假单胞菌[10]，且能对（12-）十四酸佛波酯（-13-）乙酸盐（phorbol 12-myristate 13-acetate）作出特异性应答[3]。相比健康胃上皮细胞，hBD-4在幽门螺杆菌所致感染或非幽门螺杆菌所致感染胃炎中表达均上调[11]。Supp等[12]研究证实hBD-4能抑制细菌的耐药性。Musumeci等[13]用形态学、免

疫组织化学和蛋白质印迹法证实hBD-4在骨关节炎患者膝部半月板中高表达。这些研究表明hBD-4在人体多种组织中存在，并且与组织健康有关系。但是，hBD-4在口腔中的分布情况迄今国内外尚未见报道。

本研究采用免疫组织化学技术和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real time reverse transcription-

polymerase chain reaction，real time RT-PCR）方法，从蛋白和基因两个水平检测健康牙龈组织中hBD-4的分布情况，为研究该防御素在牙周组织中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

兔二抗Envision免疫组化试剂盒（DAKO公司，德国），兔特异性hBD-4（Santa Cruz公司，美国），二

氨基联苯胺（DAB）（Thermo Scientific公司，德国），

QIAGEN RNeasy[R] MiniKit（QIAGEN公司，德国），

iCycler Thermal Cycler仪（Bio-Rad公司，德国）。

1.2 患者信息和标本收集

收集2012年3—5月就诊于四川大学华西口腔医院牙周科和颌面外科门诊行阻生牙拔除或冠延长患者的正常牙龈组织48例。标本收集通过四川大学口腔疾病研究国家重点实验室伦理委员会批准。纳入标准：牙龈探诊出血阴性，无附着丧失，无牙周袋（pocket depth，PD）（PD≤3 mm），影像学检查患牙及邻牙均未见牙槽骨吸收。所有病例均无系统性疾病，女性未妊娠。所有受试者均签署知情同意书。在48例标本中，选取30例（男9例，女21例；年龄18～57岁）标本-80 ℃冷冻保存，用于real time RT-PCR检测；18例（男8例，女10例；年龄7～41岁）标本放入多聚甲醛中保存，用于免疫组织化学检测。同时收集临床资料，包括菌斑指数、牙龈指数、牙周袋深度、临床附着水平、探诊出血等临床指标。

1.3 应用real time RT-PCR检测在正常牙龈组织中

hBD-4 mRNA的表达

1.3.1 RNA的提取和cDNA的合成 依据QIAGEN RNeasy[R] MiniKit提供的反转录试剂盒提取总RNA，-80 ℃保存。将提取的总RNA进行逆转录，该逆转录产物作为聚合酶链反应（polymerase chain reaction，

PCR）的扩增模版，每个反应管中加入10 μL RNA，用cDNA Reverse Transcription Kits合成cDNA，-20 ℃

保存备用。

1.3.2 定量检测hBD-4的表达 用iCycler Thermal Cycler仪对hBD-4行real time RT-PCR，SYBR Green作为荧光染料对PCR产物进行实时监控。引物由大连宝生物公司合成提供，hBD-4正向引物序列：5-ATGCAGAGACTTGTGCTGCTATTA-3，反向引物序列：5-AGGGTTTTGTACGATTCAGTAAG-3；β-actin正向引物序列：5-CATGGATGATGATATCGC-CGCG-3，反向引物序列：5-ACATGATCTGGGT-CATCTTCTCG-3。反应系统总体积为25 μL：12.5 μL的PCR缓冲液，9.5 μL的无酶水，2 μL的引物，1 μL cDNA作为PCR反应模版。hBD-4的检测扩增条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 1 min，循环50次，55 ℃ 1 min，55 ℃ 10 s。β-actin扩增条件为95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，69 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 1 min，循环50次，55 ℃ 1 min，55 ℃ 10 s。PCR反应结束后进行溶解曲线分析，以证实扩增产物的特异性，分析是通过实时监测SYBR Green的荧光信号强度变化进行的。管家基因β-actin作为参比基因对样品进行归一化处理，由hBD-4引物扩增的PCR产物作为PCR阳性组，水作为阴性对照组。反应结束后由计算机自动分析出每个样本目的基因与内参基因达到阈值时的循环圈数（threshold cycle，Ct），计算目的基因相对于内参基因表达的改变倍数。每个样本PCR反应重复2～3次。

1.4 免疫组织化学检测

所有标本在同一时间段、用同一批号（sc-30117）试剂进行染色，采用Strepavidin-Biotin-Peroxidase-complex（Strept-ABC）法，主要步骤分为：石蜡切片，常规脱蜡水化，缓血氨酸盐溶液（Tris-Buffered Saline solution，TBS）洗涤10 min，采用70 mL甲醇和30%过氧化氢700 μL处理10 min（阻断内源性过氧化氢酶），TBS洗涤10 min，加入兔特异性hBD-4抗血清抗体4 ℃孵化过夜，兔二抗Envision室温孵化30 min，TBS处理10 min，DAB染色8 min，TBS处理10 min，50%苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色1 s，脱水封片。所有标本在同一时间段、同一背景下，应用Aperio Scanscope Virtual scanning显微图像分析系统对免疫

组化染色后的切片进行定性检测，在物镜20、40倍下摄像分析。

2 结果

2.1 real time RT-PCR检测hBD-4在健康牙龈组织

中的表达

采用real time RT-PCR检测牙龈组织中hBD-4的表达水平，以循环内的检测结果记为阳性，30例样本中有4例样本检测出hBD-4的表达，占13%。4例阳性结果中hBD-4的相对荧光定量见图1。

2.2 免疫组织化学法检测hBD-4在牙龈组织中的定

位和分布

在18例健康牙龈标本中，13例牙龈复层鳞状上皮细胞的细胞核与细胞浆内可见棕黄色阳性染色颗粒，即有hBD-4的表达（图2～3）。

阳性染色区域包括基底层、棘层、颗粒层、角化层，但主要分布于棘层与颗粒层细胞的细胞核内；某些标本棘层与颗粒层细胞胞浆内也可见阳性染色区域，上皮下结缔组织内未见hBD-4表达。hBD-4阳性在不同个体内存在差异，阳性标本的染色强度有强有弱，某些标本在基底层与角化层细胞胞核内也有表达，但在基底层与角化层细胞胞浆内未见hBD-4表达。

3 讨论

hBD-4基因序列图谱位于人染色体8p23，可编码72种氨基酸的前多肽原[5]。人多种组织中已证实有

hBD-4的存在，如hBD-4在胃上皮细胞[3]高度表达，

在中性粒细胞、甲状腺上皮、肺上皮、子宫上皮、肾上皮细胞表达量较低[5]。研究证实：hBD-4具有广谱抗菌活性[14]，对大肠杆菌、酿酒酵母菌、金黄色

葡萄球菌、肺炎链球菌等的抗菌活性较弱，最低抑菌浓度均大于100 μg·mL-1；但对铜绿假单胞菌和肉葡萄球菌有高效抗菌活性，最低抑菌浓度分别为4.1和4.5 μg·mL-1，且hBD-4对铜绿假单胞菌的抗菌活性是其他β-防御素的6倍[3]。

本实验用免疫组织化学法和real time RT-PCR研究健康牙龈上皮hBD-4的分布情况，结果显示：两种方法均检测到健康牙龈组织中存在hBD-4。免疫组织化学法检测结果表明：18例标本中有13例能检测到hBD-4；real time RT-PCR检测结果表明：30例标本中有4例标本检出hBD-4的表达，占13%，表明hBD-4在健康牙龈上皮的基因表达的阳性率较低。本研究结果显示hBD-4表达的阳性率基因水平低于蛋白水平，其原因可能是该基因在翻译水平上存在调节；也可能是某些标本在提取RNA、合成cDNA时由于人为的不可遇见因素导致RNA的降解。Krisanaprakornkit等[15-16]研究hBD-1、hBD-2在15例健康牙龈上皮中mRNA的表达，结果显示15例样本均可检测出hBD-1，14例样本中检出hBD-2。Dommisch等[1]研究显示健康牙龈上皮中hBD-1、hBD-2、hBD-3 mRNA的表达水平差异无统计学意义。可见，hBD-4在健康牙龈上皮的表达特点可能与其他β-防御素存在差异，推测它们在牙龈组织中表达的意义和作用可能不同。

组织学研究已证实牙龈上皮组织有hBD-1、hBD-2、hBD-3蛋白水平的表达。Dale等[17]研究牙周炎患者的牙龈上皮，发现hBD-1、hBD-2可在牙龈上皮全层中发现，这与张旭等[7]对hBD-2的研究结果相同，

该研究发现hBD-2在健康人和牙周炎患者牙龈上皮细胞层次的分布无明显差异，主要见于棘层以上细

胞质内。Lu等[8]研究发现健康人hBD-3主要位于基底层，而牙周炎患者hBD-3主要位于基底层和棘层。本研究发现hBD-4主要位于牙龈上皮棘层和颗粒层细胞，尚未在结缔组织中发现。这些研究表明，迄今发现的的β-防御素表达部位均在牙龈上皮内，这与其在牙龈组织中的天然防御功能可能相关。

本研究显示健康人牙龈上皮内hBD-4主要位于棘层、颗粒层细胞胞核内，少数样本棘层与颗粒层细胞胞质内存在阳性染色区域。Yanagi等[10]研究表

明慢性下呼吸道感染患者支气管上皮细胞胞质内为hBD-4强阳性染色区域。Musumeci等[13]研究显示，骨

关节炎患者半月板表层细胞和细胞外基质内均存在hBD-4。这些研究结果表明hBD-4可分别位于细胞胞核、胞质及细胞外基质中，这也许与人体不同部位组织特性相关，是否与不同感染状态相关有待进一步研究证实。

用热灭活的铜绿假单胞菌或肺炎链球菌刺激人呼吸上皮细胞，可增加hBD-4在呼吸上皮细胞的表达[5]，体外肺上皮细胞在（12-）十四酸佛波酯（-13-）乙酸盐刺激下可增加hBD-4的表达[18]。这为hBD-4

在免疫防御中起作用提供了可靠证据。在培养的上皮角化细胞中，用基因修饰法异位表达hBD-4，上皮角化细胞抗菌活性显著增加[9]，这为创口修复中，持续输送hBD-4达创伤组织以抵御创口感染的治疗方案提供依据。hBD-4对微生物耐药性所致感染有较高疗效，包括耐甲氧西林金葡菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌[12]，为耐药微生物所致感染的治疗提

供了新的导航。口腔为人体四大菌库之一，单个个体口腔内有500余种细菌[19]，但仅部分人会患牙周疾病，这不仅与微生物菌群平衡相关，宿主防御因素也必不可少，本实验证实hBD-4在牙龈上皮内表达，还需进一步研究探索其在宿主免疫防御中的作用。

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（本文编辑 杜冰）