不同条件对胰蛋白酶水解酪蛋白水解度的影响

于传瑞,杜开书,吴菲,申文鹏,娄伟强,丁凯,李淑梅

（河南科技学院,河南新乡453003）

酪蛋白是牛乳中主要的蛋白质,约占牛乳蛋白质总量的80%～82%,是一种全价蛋白质,酪蛋白能够为生物体提供必需氨基酸,但酪蛋白坚硬、致密,极难补充消化吸收[1-2].为此,人们通过对酪蛋白进行水解获得多肽类物质,这些多肽类物质不仅具有营养价值,而且使其吸收利用率大为增加,更重要的是使其具有原蛋白质或其组成氨基酸所没有的功能.目前,在酪蛋白水解物中发现许多多肽类物质,如抗菌肽、免疫活性肽、促进矿物离子吸收肽等.因此,确定蛋白质合适的水解条件尤为必要[3-6].但是目前水解存在的问题是：为了追求高水解度,蛋白酶大剂量使用导致成本增加,酶浪费严重.本试验在酶剂量和pH不变的前提下,研究了不同温度、不同作用时间对酪蛋白水解度的影响,再通过加入SDS来提高水解度,目前尚无类似报道.

1 材料与方法

1.1 试验材料

酪蛋白的制备：取1 kg的鲜牛乳,脱脂后醋酸－醋酸钠缓冲液调至pH 4.6,使酪蛋白沉淀,4 000 r/min离心15 min后,收集沉淀,再用水洗涤酪蛋白沉淀,再次离心去掉上清液,将沉淀冷冻干燥,即得酪蛋白[7].

1.2 化学试剂

胰蛋白酶（Trypsin,上海紫一试剂厂生产,活力单位 1∶250）,20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.9）,0.5 mol/L的NaOH等,其他试剂均为分析纯.

1.3 酪蛋白的水解

准确称取1.000 0 g的酪蛋白,用25 mL 20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.90）溶解,调节其pH至7.0,加入10 mg胰蛋白酶,置于一定温度的水浴锅中进行水解,加入不同剂量的SDS混匀,经过一定反应时间后,将反应体系置于100℃水浴锅中煮沸5 min,使胰蛋白酶失活,反应终止[8-9].

1.4 水解度的测定

水解开始时,调节反应体系的pH为7.0,反应结束后,先测定反应体系的pH值,再用0.5 mol/L的NaOH将反应体系的pH调到原来的pH值7.0,记录下所用的碱液的量,按下式即可计算出酪蛋白的水解度：水解度 DH/%=B（Mb）（1/α）（1/MP）（1/htot）×100.其中：B为消耗的 NaOH 的体积 /mL,Mb 为 NaOH的浓度/（mol/L）,α为氨基酸的解离度；在pH 7.0,50℃的试验条件下,对于酪蛋白,1/α为2.26；MP为蛋白质的质量/g,htot为每g原料蛋白质中肽键的毫摩尔数,对于酪蛋白,该值取8.2[10-11].

2 结果与分析

2.1 温度对酪蛋白水解度的影响

在pH 7.0,底物浓度为4%,酶添加量为2 500 U/g时,分别在30、40、50、60和70℃温度下反应60 min,得到温度对酪蛋白水解度的影响,结果见图1.

图1 温度对酪蛋白水解度的影响Fig.1 Influence of temperature on hydrolysis ofcasein

由图1可知,温度为30℃时,酪蛋白水解度仅为2.87%,随着反应体系温度的升高,酪蛋白水解度逐渐增大,50℃时,水解度趋于最大值,其水解度为6.92%.当温度高于60℃时,随着温度的升高,胰蛋白酶逐渐变性失活,酪蛋白的水解度反而呈现下降趋势.因此,试验选取50℃为最佳水解温度.

2.2 作用时间对酪蛋白水解度的影响

在pH 7.0,底物浓度为4%,酶的添加量为2 500 U/g,反应体系温度为50℃条件下,测定不同水解时间对酪蛋白水解度的影响,结果见图2.

图2 作用时间对酪蛋白水解度的影响Fig.2 Influence of time on hydrolysis ofcasein

由图2可知,酪蛋白的水解度随酶解时间的延长而增大.当反应时间在40～80 min时,水解度增长较快；当水解时间超过80 min后,水解度随时间的增加而增大,但其增幅趋于平缓.考虑到时效性,试验选取80 min为最佳水解时间.

2.3 SDS对酪蛋白水解度的影响

在pH 7.0,底物浓度为4%,酶的添加量为2 500 U/g,反应温度为50℃,反应时间为80 min条件下,测定不同剂量的SDS对酪蛋白水解度的影响,结果见图3.

图3 SDS对酪蛋白水解度的影响Fig.3 Influence ofSDSon hydrolysis ofcasein

由图3可知,随着SDS浓度的增加,酪蛋白水解度逐渐增大,当反应体系中SDS 的质量浓度为0.001 28 g/mL时,酪蛋白的水解度达到最大值13.5%.因此,试验选取0.001 28 g/mL为SDS最佳加入浓度.

3 结论

通过单因素试验得出在底物浓度为4%、加酶量2 500 U/g、pH为7.0的条件下,选择温度为50℃,水解时间为80 min,胰蛋白酶对酪蛋白的水解效果较佳,水解度为7.30%；同等条件下向此体系加入SDS,使SDS在体系中的终浓度为0.001 28 g/mL,水解度提高为13.50%,可见SDS对胰蛋白酶水解酪蛋白有明显促进作用.

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