杜仲叶中绿原酸的提取分离及结构鉴定

杨秀芳，汪洋，马养民

（陕西科技大学教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室，陕西西安 710021）

杜仲（Eucommia ulmoides Olive）为杜仲科杜仲属植物，仅一属一种。杜仲在我国研究和利用已有两千多年的历史[1]。传统中医以皮入药，但树皮生长缓慢，种植10年～20年后才能剥皮，每年杜仲皮的增长量仅为0.4 kg左右，紧缺的药源无法满足人类的需求[2]。为了保护和扩大药源，杜仲以叶代皮研究日益活跃，研究发现杜仲叶与皮有着相似的药理作用和化学成分，杜仲叶在临床上也具有较好的疗效[3]。杜仲属于落叶乔木，杜仲叶具有廉价、采摘方便、可循环再生等特点。这为杜仲叶的进一步利用奠定了物质基础，也为缓解紧缺的杜仲资源开辟了途径[4]。

杜仲叶中富含活性化合物绿原酸，绿原酸又称3－咖啡酰奎尼酸，是一种广泛分布于植物体内的苯丙素类物质。经研究发现其具有抗菌、抗炎、保肝、利胆等多种功效，广泛的应用于医药、食品、日用化工等行业，对绿原酸的提取纯化为合理开发杜仲资源具有十分重要的意义[5]。本实验通过对杜仲叶中绿原酸提取工艺和分离纯化方法进行了研究，进一步为杜仲综合利用提供参考。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器与设备

SENCO电热恒温浴锅：上海申生科技有限公司；RE52CS－1旋转蒸发器：郑州南北仪器设备有限公司；Unic－2100型紫外可见光分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司；X－6精密显微微量熔点测定仪：巩义市予华仪器有限责任公司；Bruker avanceⅢ－400Hz超导核磁共振仪：瑞士布鲁克公司。

1.2 材料与试剂

杜仲叶、皮均采自西北农林科技大学苗圃；绿原酸标准品：中国药品生物制品检验所；D－101大孔吸附树脂：山东鲁抗医药股份有限公司；柱层析硅胶：青岛海立信精细硅胶化工有限公司；薄层层析硅胶G：青岛久隆盛业硅胶干燥剂有限公司；Sephadex LH－20：上海宝曼生物科技有限公司；甲醇、乙酸（色谱纯）。

2 方法和结果

2.1 绿原酸水提工艺研究

2.1.1 绿原酸标准曲线的建立

准确称取绿原酸标准品2.5 mg，甲醇溶解并定容至50 mL，得到绿原酸标准溶液（0.05 g/L）。分别从标准溶液中精确移取 1、2、3、4、5、7 mL 溶液至 10 mL 容量瓶中，甲醇定容，紫外分光光度计于328 nm处测定其吸光度[6]。以绿原酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程。

2.1.2 水提法正交试验

以水提法作为杜仲叶中绿原酸的提取方法。在单因素实验的基础上，选取料液比、提取时间、提取温度为考察因素进行正交实验，正交因素设计见表1。

准确称取阴干粉碎后的杜仲叶2 g，以水为溶剂，按正交水平表的工艺条件提取2次。提取液过滤并减压蒸干，用甲醇溶解，过滤除去不溶物。将滤液转移至50 mL容量瓶中，甲醇定容。再从上述容量瓶中精确移取1 mL溶液到100 mL容量瓶中，定容，利用紫外可见光分光光度计測其吸光度，由标准曲线得出绿原酸含量并计算得率。

表1 正交因素表Table 1 Factors of orthogonal experiments

2.1.3 实验结果

依据实验数据，绘制标准曲线见图1，建立回归方程。

图1 绿原酸标准曲线Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

由标准曲线可知，绿原酸在5mg/L～35mg/L浓度范围内线性关系良好，回归方程为：y=0.061 4x－0.056 39，r=0.999 79，SD=0.015 26。水提法提取绿原酸正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Result of orthogonal experiments

极差分析表明，各因素对绿原酸得率的影响程度为：C＞A＞B，即提取温度对绿原酸得率影响最大，其次是料液比，影响最小的因素是提取时间。比较A、B、C等因素的K1、K2和K3数据，3个因素的最优组合是A2B1C2，即绿原酸水提法的最佳工艺条件是：料液比为1∶8，提取时间 70 min，提取温度 80℃，以热水作为溶剂提取杜仲叶2次，测得此条件下的绿原酸得率为1.78%。

2.2 绿原酸的纯化工艺研究

2.2.1 绿原酸的纯化

将杜仲叶阴干并粉碎，按2.1.3确定的最佳工艺进行提取。将提取物减压浓缩得到粗提物。向粗提物中添加等量的工业酒精，经过多次的搅拌、沉淀，乙醇部分合并，减压浓缩至无乙醇蒸出。通过此操作除去浸膏中大量的多糖、淀粉、蛋白质等得粗浸膏。利用D－101大孔吸附树脂纯化所得粗浸膏，水－乙醇进行梯度洗脱，收集水相部分，减压浓缩得到浸膏。利用硅胶柱层析进一步对浸膏进行纯化。以乙酸乙酯－甲醇进行梯度洗脱（乙酸乙酯－甲醇体积比分别为 1∶0，20∶1，10∶1，5∶1，10∶3，5∶2，2∶1，5∶3，10∶7，1∶1，0∶1），利用薄层层析，结合标准品对化合物进行比较。经薄层层析后发现5∶2梯度洗脱液含有与绿原酸标准品相同Rf值的斑点。经多次硅胶柱层析后，再以甲醇为洗脱剂，利用Sephadex LH－20凝胶柱层析进行纯化。收集、合并与标准品具有相同Rf值斑点的洗脱液，挥干洗脱剂后得到白色固体。

2.2.2 化合物纯度检测与结构鉴定

以不同极性的展开剂将上述白色固体进行薄层层析，显色后在紫外灯下进行观察，看是否呈现单一斑点，若始终呈现单一的特征斑点；或利用熔点仪测定熔点，若熔程较短且与文献值相符，可确定为纯品化合物。

同时，利用1H－NMR、13C－NMR等波谱技术进行分析测定，确定化合物的结构。

2.2.3 结果

2.2.3.1 纯度的检测

分离得到的白色固体，易溶于乙醇、丙酮等极性溶剂，难溶于氯仿等低极性溶剂。经检测其熔点为207℃～208℃，与绿原酸的熔点相同，向白色固体中加入少量绿原酸标准品，其熔点不发生变化。同时薄层色谱呈现出单一斑点，且与标准品有相同的Rf值，由此可初步确定白色固体为绿原酸。

2.2.3.2 结构鉴定

1H－NMR（400 Hz，DMSO－d6）δ：12.45（1H，s，H－7′）为羧基氢的信号峰；9.63（1H，s，H－4），9.19（1H，s，H－3）为苯环上羟基氢的信号峰；7.04（1H，d，J=1.8，H－2），7.00 （1H，dd，J=1.8Hz，8.2Hz，H －5），6.78 （1H，d，J=8.1Hz，H－6）为苯环上未被取代的氢原子信号峰；7.44（1H，d，J=15.9 Hz，H－7），6.17（1H，d，J=15.9 Hz，H－8）为烯基氢的信号峰；5.57，4.98，4.81为与六元环直接相连的羟基氢信号峰；5.08（1H，m，H－3′），3.57（1H，s，H－4′），3.92 （1H，s，H－5′），2.05 （2H，m，H－6′），1.95（2H，m，H－2′）为六元环上的氢原子信号峰。

13C－NMR （100 Hz，DMSO－ d6）δ：126.02 （C－1），116.17（C－2），148.79（C－3），145.43（C－4），115.20（C－5），121.84（C－6）为苯环上的六个碳原子的信号峰；146.00（C－7），114.69（C－8）为烯基碳的信号峰；166.17（C－9）为酯基碳的信号峰；73.84（C－1′），37.63（C－2′），68.42（C－3′），71.34（C－4′），70.68（C－5′），36.54（C－6′）为六元环上的碳原子信号峰；175.41（C－7′）为羧基碳的信号峰。

以上核磁数据与文献[7]中绿原酸的数据基本一致，故鉴定该白色固体为绿原酸。

3 结论

研究表明杜仲叶中绿原酸的含量远大于其皮中的含量。本文探讨了杜仲叶中绿原酸的提取工艺，为开发利用该资源提供了有益的参考。杜仲叶中绿原酸的最佳水提工艺条件为：料液比1∶8，提取时间70 min，提取温度80℃，以水作为溶剂提取杜仲叶2次，测得此条件下的绿原酸得率为1.78%。粗提物经醇沉工艺除杂后，依次利用D－101大孔吸附树脂、硅胶柱层析、Sephadex LH－20凝胶柱层析对所得浸膏进行纯化，分离得到的化合物经1H－NMR、13C－NMR波谱鉴定和文献对比为绿原酸。

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