原料乳中微生物的多样性*

剧柠，夏淑鸿

1(宁夏大学农学院，宁夏银川，750021)2(宁夏兽药饲料监察所，宁夏银川，750011)

牛乳营养丰富，适合人类食用外，其较高的水分含量和接近中性的pH值也非常适合各种微生物的生长与繁殖［1］。因此，牛乳中存在着复杂的微生物菌群。这些菌群有的可以使乳及乳制品产生理想风味、有的引起乳及乳制品腐败变质，甚至有的还可以使人类产生疾病［2］。传统方法对原料乳中微生物的研究主要是以纯培养为基础展开的。该方法对菌种的定义取决于对微生物的分离和培养，耗时费力。更重要的是该方法不可避免的忽略了原料乳中占有相当大比例的、无法通过培养获得的微生物菌种。出于该原因，近些年随着分子生物学技术的发展，人们开始越来越多地关注于应用非培养微生物学的技术研究原料乳中的微生物，并取得了很大进展。

1 原料乳中的微生物

原料乳中含有丰富的微生物，数量从几百到几千个cfu/g不等［3］，随着冷藏过程的延长，其中的微生物发生着变化。所有这些微生物可利用原料乳中的蛋白质、脂肪和乳糖，维持自身生存的同时对乳质产生影响;而其中致病菌的存在则可能引起食品安全问题。原料乳中常见的微生物有3大类，即病原微生物、有害微生物和有益微生物。

1.1 病原微生物

病原微生物是指虽然不改变乳的性质，但对人体有害的病原菌。牛乳中混入病原菌，贮存不当时便会生长代谢产生毒素，在后期加工中虽然病原菌被杀死，但毒素仍有活性，从而使人体中毒。这些病原菌主要有:沙门氏菌、阪崎杆菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、结核杆菌、布氏杆菌、葡萄球菌以及无乳链球菌等［3］。

1.2 有害微生物

有害微生物常称为腐败菌，其中最主要的就是嗜冷菌。这类菌可在原料乳低温贮藏的过程中生长，其产生的蛋白酶和脂肪酶经高温灭菌后仍有活性，可分解乳中的蛋白质和脂肪，对工业生产带来极大不便。这类菌主要包括假单胞菌属、黄杆菌属和产碱杆菌属。Dina Raats等［4］采用DGGE技术分析，发现其中占主要比例的菌群均为假单胞菌属。由于嗜冷菌对产品造成的危害较大，近年来国内外对其研究较为详细，对其检测及鉴定的研究在本文2.2处将有详细论述。

1.3 有益微生物

原料乳中有益微生物主要是乳酸菌，而乳酸菌主要包括链球菌属、明串珠菌属和乳杆菌属。它们被分离出来广泛地应用于乳制品的生产中。属于链球菌属的乳酸链球菌几乎在所有生鲜乳中都能检出，它是原料乳酸度升高的主要原因。该菌可以产生乳酸链球菌素(NISIN)，抑制其他细菌的繁殖。明串珠菌由于其可以分解柠檬酸生成香味物质丁二酮，在生产中应用其产生独特的风味。乳杆菌属中最具代表的是保加利亚乳杆菌，它可以和链球菌属中的嗜热链球菌共同作用生产酸乳。此外，属于乳杆菌属的嗜酸乳杆菌被认为是通过筛选，可以有效调节肠道的良好益生菌;干酪乳杆菌是用于生产干酪的主要菌种。

1.4 其他微生物

除上述细菌外，原料乳中还存在着其他庞大的微生物群。例如、大肠菌群、丙酸菌、丁酸菌、微球菌等。除细菌外，原料乳中还含有酵母、霉菌、放线菌以及噬菌体等微生物。

2 国内研究进展

我国关于原料乳中微生物的研究主要集中在微生物污染状况，腐败菌的鉴定以及致病菌的快速检测方面;对原料乳从挤入直至加工前整个阶段的菌群结构及变化报道较少。

2.1 关于原料乳中细菌总数监测的研究

原料乳的污染状况主要以细菌的菌落总数为主要指标。目前国内还主要采用传统纯培养的方法，通过菌落总数这一指标，对原料乳微生物的污染情况、污染来源以及随季节和温度的变化进行研究。何开兵［5］对新疆石河子生鲜牛乳微生物状况进行检验，发现牛场微生物污染严重，甚至有超标现象。黑龙江省兽药饲料监察所［6］对2011年黑龙江省生鲜乳中菌落总数监测情况显示，乳头样品的菌落总数＜冷藏储奶罐中样品的菌落总数＜运输车样品的菌落总数。李博等［7］对不同季节原料乳中主要微生物和理化指标进行分析，结果显示与春夏相比，冬季牛乳的营养成分较高、细菌总数较低。崔海辉［8］通过测定菌落总数的方法研究了原料乳质量和贮存温度及贮存时间之间的关系，结果表明在4℃贮存条件下，原料乳存放36 h，对质量没有较大的影响;在原料乳温度达到10～15℃的时候，存放时间不宜超过12 h。

在采用传统培养方法的同时，国内的工作者也积极探讨其他方法监测细菌总数，包括早先的基于计算机技术的给予支持向量机的分类技术［9］、基于电导率微生物检测技术［10－11］等都或多或少的存在各自的局限。田丽萍［12］等通过使用ATP生物发光技术与FOSS细菌总数测定仪检测原料乳中细菌总数的比较实验，确定了ATP生物发光技术与FOSS细菌总数测定仪的检测结果具有良好的相关性，且成本低廉，是一种值得推广的新型技术。

2.2 关于腐败菌的研究

嗜冷菌污染是现代乳制品加工过程中最常见的问题［13］。该菌在原料乳的冷藏过程中大量繁殖，逐渐变为优势菌，经过加热虽然可以被杀死，但它其中的某些菌产生的耐热蛋白酶和脂肪酶能够分解蛋白质、脂肪，从而导致乳制品品质发生变化，如出现苦味、腐败味或形成胶凝。嗜冷菌几乎覆盖了乳中常见细菌的所有类群，较为常见的有:假单胞杆菌、产碱杆菌、产气杆菌、沙雷氏菌、克雷伯氏杆菌。任静［14］选用Sherlock全自动微生物鉴定系统，从40份原料乳样品中分离筛选得到30株嗜冷菌。同时，研究指出原料乳中占优势的嗜冷菌，为腐臭假单胞菌、小球诺卡氏菌、粪鞘脂杆菌和恶臭假单胞菌。吕元［15］以杭州地区牧场的原料奶为对象，对其中的嗜冷菌进行分离鉴定，确定其中的优势嗜冷菌种为荧光假单胞菌、鲁氏不动杆菌和阪崎肠杆菌。除传统纯培养方法对嗜冷菌进行分离鉴定外，近些年，研究者也找寻着其他一些方法来对嗜冷菌进行鉴定。关晶岩等［16］根据嗜冷菌中占优势的假单胞菌属，选择特异性引物进行PCR扩增;建立了一种原料乳中快速PCR计数嗜冷菌的新方法。该方法与国际标准计数法比较无明显差异，却可以大大缩短计数时间。吕元［17］研究发现嗜冷菌数量和对硝基苯胺浓度之间有着很好的线性关系，建立的胺肽酶法检测嗜冷菌的技术，适用检测自然条件下腐败的原料奶中嗜冷菌的数量。此外，岳喜庆［18］采用Azocasein法和碱式滴定法对嗜冷菌产蛋白酶和脂肪酶的活力进行了测定。研究了嗜冷菌在原料乳中的生长规律。说明了原料乳在低温贮藏过程中，嗜冷菌数与蛋白质、脂肪、水分、密度、pH值也存在有数学相关性。可见，国内对嗜冷菌的研究涵盖了菌种的分离鉴定、生长特性及产酶特性、快速检测以及对乳制品品质的影响等多方面的研究。

2.3 有关致病菌的监测

牛乳易感染金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等具有致病性的微生物。国内近些年对这些致病菌的研究主要侧重于菌种的快速检测、溯源、风险评估以及产毒情况的研究。目前使用的检测方法大多采用分子方法对特定致病菌进行特异性扩增，该检测方法具有快速、简单、灵敏度高的特点。刘继超［19］等通过多重PCR的方法，建立了一种快速检测沙门氏菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的方法，该方法具有简单、快速、灵敏度高的特点。周微［20］等利用荧光定量PCR技术建立起一种快速检测原料乳中大肠杆菌数量的方法。姜毓君［21］等利用过滤富集菌体后的PCR技术来检测原料乳中大肠杆菌O157:H7，在传统检测方法的基础上做了有效改进，使得原料乳中的大肠杆菌O157:H7的检测能够快速、准确、灵敏地进行。闫军［22］等采用PFGE对个体养殖户、奶站和奶牛场的2批样品(土壤、牛粪、装奶空桶、牛体后臀、乳房、头3把奶、桶中奶和人手)的金黄色葡萄球菌分离菌株进行溯源分析，结果表明，头3把奶的污染会不同程度地由牛后臀和牛粪引起，而桶中奶则被人手、空桶和土壤污染。虽然溯源结果表明原料乳的污染是外源性原因引起的，但是不能排除乳房炎造成的交叉污染。

产孢菌是另一类存在于乳中的可以导致腐败和致病的菌群。这类种群包括芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌及枯草杆菌等。其中蜡样芽孢杆菌产生的致吐肠毒素可导致呕吐腹泻症状，容易与乳糖不耐症混淆，而被忽视。因此，吴海清［23］对原料乳中的蜡样芽孢杆菌的污染情况进行了调查。结果表明蜡样芽孢杆菌数与原料乳的微生物污染状况无相关性。赵宁［24］对蜡样芽孢杆菌采用PCR技术进行检测，整个过程只需6h，是对传统方法的有效改进。

对于致病菌的风险评估，遇晓杰等采用对奶牛场及奶户进行抽样调查，确定原料乳中的特征性致病菌并采取预测微生物学的方法，建立了原料乳中该致病菌的最适生长模型。同时，结合流行病学资料以及对该地区原料乳收购过程的调查，最终建立原料乳中金黄色葡萄球菌的防控措施。

3 国外研究进展

国外的研究者很早就开始关注原料乳质量问题，对影响原料乳质量的菌群的研究方法也从传统纯培养的方式转变成采用分子生物学手段［25－26］，使得结果更加准确及时。近些年来，研究者对原料乳直至加工前的微生物监测延伸到各个方面，并且取得了一些有用的信息，为工业化生产乳制品(特别是奶酪)提供了有利的保障。国外研究主要从以下几方面入手:

3.1 环境与原料乳中微生物菌群的关系

Martina Fricker等［27］采用纯培养和分子方法相结合，使用FTIR和16S rDNA测序的方法对来自于欧洲3个国家农场和工厂奶罐中的微生物进行检测，结果发现工厂和农场奶罐中的微生物菌群结构明显不同，但各地理环境之间无明显差异。Bonizzi［28］等对来自于意大利西北地区高山、峡谷和低洼地带的牛乳，采用ITS分析其中的微生物，发现3个不同环境中的微生物构成不同。Hagi等［29］对不同饲喂方式下原料乳的微生物群系进行了研究，发现户外与室内饲养时的优势菌群均为乳杆菌，但在户外饲养8 d后出现了葡萄球菌。Dina Raats［30］等采用 DGGE和克隆文库的方法对原料乳及其冷藏过程中菌群的变化进行研究，发现原乳中主要是杆菌属、梭菌属和放线菌属的G+菌，而冷藏后主要菌群转变为的G－菌。研究还发现对乳腐败起作用的放线菌在农场乳样中占一定比例，在评估最初原料乳质量时应得到重视。此外，原料乳中存在的酵母菌群也不容被忽视，他们对乳制品风味的影响不容忽视［31］。以上研究说明，原料乳中的菌群结构受所处地理环境、饲喂方式的影响，并随冷藏时间以及冷藏温度的不同而发生变化。

3.2 用于原料乳微生物多样性研究的分子生物学方法的建立

由于分子生物学技术可以做到对多数无法培养的微生物的监测，采用分子生物学的手段研究微生物的多样性是近些年的一个热点。因此，选用适当的分子生物学方法以及对该方法的改进是能否全面准确地对原料乳中的微生物进行描述的关键。

3.2.1 DNA的提取

采用分子生物学的方法研究类似原料乳这种含有复杂菌群的样品，关键在于从样品中所提取的DNA浓度和纯度。高纯度和浓度的DNA对后续试验的精确度起着重要作用。

碳水化合物，蛋白质和盐类的存在会妨碍核酸提取。通过机械(离心、冷冻、锆珠破碎等)、酶裂解细胞、蛋白质消化和DNA沉淀都可以提高DNA的提取能力。Duthoit［32］比较了4种方法提取的DNA的效果，结果表明采用苯酚提取的方法效果最好。此外，目前在许多研究中，实验者直接采用核酸提取试剂盒来提取DNA，从而获得高纯度的DNA。

3.2.2 目的基因的选择

基因组DNA提取后，就需要选择目的基因片段进行研究。目前用来分析菌种归属的主要目的基因为16S rDNA片段或16S～23S rDNA间区。其中对16S rDNA V3区的扩增最为常见，其次才是对V4区的扩增。此外，研究者也选用其他目的基因，看家基因序列分析技术就是其中之一。看家基因pheS和rpoB就常被用来分析菌群多样性。Lafarge等［33］使用rpoB引物对来自乳中的菌种进行PCR扩增，经DGGE凝胶电泳后每个菌种都有一条单一的条带，与16S rDNA的V3区的电泳图谱比较后证明rpoB可以替代16S rDNA的V3区用来定义乳及乳制品中的腐败和致病菌。

3.2.3 分子标记技术的选择

如今，国际上已广泛使用分子标记技术对菌种进行鉴定。研究者可以通过16S rDNA测序后在基因库中与标准菌株序列进行比较确定菌种归属。也可以通过焦磷酸测序、DGGE/TGGE、T-RFLP、SSCP、FISH、qPCR等技术研究原料乳中微生物多样性。以上分子标记技术都有其自身的优缺点。这些技术可与无需培养或纯培养技术相结合，针对需要解决的特定问题，选择正确的分子标记技术，可达到事半功倍的效果。例如，qPCR技术可用来对微生物进行定量，但对复杂样品中微生物的多样性的确定十分有限，且使用该技术检出率低，重复性较差。DGGE技术是近年来用于分析类似原料乳这种复杂样品中微生物多样性的常用方法。该方法的优点是样品中的微生物无需经过纯培养即可得到分析，更大程度上使无法培养的微生物检出，弥补了纯培养复杂费时的缺点。此外，DGGE和T-RFLP还可以用来半定量样品中的微生物。但是，通常DGGE技术需要使用具有高GC含量的引物以防止DNA在电泳过程中完全解链，这就会导致PCR退火过程中产生人为误差，如果16S片段高度相似的话，会导致样品多样性被误判［34］。焦磷酸测序技术是新一代DNA序列分析技术。使用该方法无需对样品进行克隆，可以同时进行超过30 000个序列的分析技术，与第一代测序技术相比，在分析微生物群落结构上具有更为快速、高效的特点。该技术已被用于研究海产品［35］、蔬菜［36］、米糠［37］及干酪［38］等食品中的微生物群落，取得了较好的效果。迄今为止，这种方法还没有大规模地应用于原料乳中微生物的监测，随着科技的发展，该技术的应用将更加普遍。

3.2.4 纯培养方法与非培养方法的比较

基于分子生物学方法的非培养技术在对很多难培养或不可培养微生物的研究方面有着其独特的优势［39］。使用非培养的方法，原料乳中以前没有检出过的微生物得以发现，对研究原料乳变化以及乳制品生产起着积极作用。Callon等［40］采用SSCP和RFLP技术对山羊乳进行整个泌乳周期的跟踪，发现乳中存在一些与干酪生产相关的非典型菌种，如棒状乳杆菌和短乳杆菌以及一些非典型嗜盐微生物，该研究对干酪风味随原料奶质量的季节变化的研究具有积极作用。此外，非培养技术对原料乳中致病菌的快速检测也起着积极作用。例如，Slana等［41］对345份乳样的检测中，使用纯培养的方式监测8个月未检出MAP，而采用qPCR技术其中有111个样品呈阳性，qPCR技术的检测水平可以达到10个细胞/mL牛乳。

值得注意的是，纯培养和非培养的方法检测乳及乳制品中的微生物，它们之间存在着一定的偏差，例如表1中所示，有时采用同样的样本，纯培养技术发现的微生物多样性更加丰富。这就要求研究者在今后的多样性研究中增加非培养技术的可靠性，从而更好地发挥非培养技术的优势。

表1 应用纯培养和非培养技术对乳制品中的微生物的研究比较Table 1 Comparison of studies employing both culture-dependent and culture-independent techniques for the analysis of microbial communities of milk products

4 总结与展望

由于PCR技术的发明，微生物生态领域在速度和分子方法上发生了深刻变革，使我们对不同环境下微生物菌群的结构及菌群动力学具有了深刻的了解。本综述介绍了国内外近年来关于原料乳中微生物多样性的研究进展。并对非培养微生物学在研究原料乳中微生物多样性的应用进行了总结，高度评价了非培养方式的快速、敏感以及可定义纯培养方式无法发现的微生物的特点。随着分子标记技术的改进以及下一代测序技术的深入研究，人类在食品微生物领域的研究将更加深入，这其中就包括在原料乳及乳制品中的微生物多样性方面的研究。

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