规模化制备藻蓝蛋白工艺技术研究进展*

邵明飞，赵楠，刘冰，秦松

1(南京农业大学资源与环境科学学院江苏省海洋生物学重点实验室，江苏南京，210095)2(曲阜师范大学化学与化工学院，山东曲阜，273165)3(中国科学院烟台海岸带研究所生物资源实验室，山东烟台，264003)

藻蓝蛋白作为天线捕光色素蛋白，是由一个辅基蛋白与藻蓝胆素(开链线性四吡咯)共价结合而成，其基本构架是由α亚基与β亚基形成单聚体(αβ)，然后单聚体间通过连接多肽形成三聚体(αβ)3或者六聚体(αβ)6。α亚基84位处的半胱氨酸与β亚基84位处、155位处的半胱氨酸各通过硫醚键共价连接藻蓝胆素［1－2］。

藻蓝蛋白是一种天然蓝色色素，已作为食物色素添加在软饮料，口香糖，唇膏，眼线等产品中。高纯度的藻蓝蛋白因其具有高效的荧光性，被作为生物化学探针应用在免疫分析研究［3－4］。藻蓝蛋白具有抗氧化、增强机体免疫力、保肝护肝、抗癌、抗炎等诸多生理活性，具有重大的潜在药用开发价值［1，5－9］。藻蓝蛋白主要从螺旋藻、鱼腥藻等藻类中提取纯化得来，不同纯度(A620/A280)的藻蓝蛋白有不同的用途。A620/A280大于等于0.7时，藻蓝蛋白为食品级;A620/A280大于等于3.9时，藻蓝蛋白为反应级;A620/A280大于等于4.0时，藻蓝蛋白为分析级［10］。藻蓝蛋白具有十分广阔的应用前景，但繁琐的纯化步骤不仅制约着它的大规模生产也导致其价格昂贵。食品级藻蓝蛋白的价格约为0.13美元/mg，分析级的藻蓝蛋白价格为1 ～5 美元/mg［11］。

藻蓝蛋白纯化过程的费用约占其成本的50%～90%［12］。藻蓝蛋白传统纯化方法包括:(1)破碎细胞，制备藻蓝蛋白粗提液;(2)应用传统的分离技术纯化藻蓝蛋白，如离心、硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析等。这些方法耗时、复杂，难以大规模制备藻蓝蛋白［13］。近几年新技术如双水相萃取技术、反胶团萃取技术、膜分离技术、扩张床吸附层析等的不断发展给藻蓝蛋白规模化制备工艺的提升提供了新机遇。本文对这些新技术在藻蓝蛋白规模化制备上的应用研究进行了综述。

1 双水相萃取技术

大部分萃取采用的一个是水相，另一个是有机相。但有机相溶液易使蛋白质等生物活性物质变性。一些高分子水溶液(如分子质量从几千到几万的聚乙二醇与磷酸盐组合成的水溶液)可以分为2个水相，生物质在2个水相中的溶解度有很大的差别，进而选择性分配［14］，故可以利用双水相体系萃取分离蛋白质等水溶性的生物产品。很多实例报道表明双水相体系已成功应用于大规模处理富集分离生物物质［15］。

Patil等［12，16］设计了一个简单而高效的技术流程，该流程包括2个步骤:双水相萃取和离子交换吸附层析，其研究结果:从螺旋藻中得到的藻蓝蛋白粗提物，其纯度为1.18，经过双水相萃取后，纯度提高为5.22，继续经离子交换吸附层析柱纯化 ，纯度从5.22上升为6.69。操作流程具体如下:(1)用蒸馏水清洗新鲜螺旋藻2～3次，洗涤干净的螺旋藻经压力为200～400 kg/cm2的高压细胞匀浆机破碎5～6 min。将破碎的螺旋藻悬浊液于离心机中离心 10 min，转速为10 000 r/min，得到的藻蓝蛋白粗提液于4～5℃下储存;(2)向藻蓝蛋白粗提液中加入总体系质量分数为12.28%的聚乙二醇和11.63%的磷酸钾盐，彻底搅拌1h，静置过夜使两相分开，分别移取上下相的溶液，在波长280，620，650 nm处测上下相溶液的吸光度，计算各相藻蓝蛋白的质量浓度和纯度;(3)经上述步骤富集分离得到的藻蓝蛋白液过DEAE-Sephadex阴离子交换层析柱，采用0～0.35 mol/L的NaCl进行线性洗脱，收集NaCl浓度为0.25～0.3 mol/L时的洗脱液，透析冻干成粉。刘杨等［17］以PEG/硫酸钠双水相体系，从钝顶螺旋藻细胞破碎液中富集分离藻蓝蛋白。其研究结果表明，萃取最适条件为 1%KCl，15%Na2SO4，12%PEG4000，分离因素达到6.33，分配系数达到8.01，藻蓝蛋白回收率为91.2%。

双水相萃取技术在富集分离生物活性物质上具有以下优势:(1)两相含水量均高达70% ～90%，适于提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活;(2)不存在有机溶剂残留问题;(3)易于放大和连续操作，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低［18］。

2 反胶团萃取技术

反胶团是指非极性溶剂中表面活性剂分子浓度超过临界胶束浓度引发形成的表面活性剂的极性头朝内、非极性头朝外的具有极性内核的多分子聚集体［19］。反胶团的极性内核可溶解少量水而形成微型水池，可溶解蛋白质、核酸、氨基酸等生物物质。微型水池周围包裹的一层水膜以及表面活性剂极性头的保护可避免生物物质与有机溶剂直接接触而失活。通过调节水相pH值及盐离子浓度等因素使生物物质反萃取到水相中，实现生物物质的溶解和分离［20］。

刘杨等［21］采用 CTAB/正戊醇-正辛烷反胶团溶液萃取分离藻蓝蛋白，并研究了有机相中助剂浓度、表面活性剂浓度与水相中离子种类、强度等因素对萃取效果的影响。研究结果表明，采用0.04 mol/L CTAB/正戊醇-正辛烷(体积比1∶4)的反胶团溶液萃取pH 7.0的螺旋藻细胞破碎液(包含0.1 mol/L KCl)，分配系数达26.0，藻蓝蛋白萃取率达96.3%;采用pH 5.0的反萃取液(包含2 mol/L KBr)反萃取藻蓝蛋白，反萃取率达90.6%。具体操作步骤:(1)称取0.5 g螺旋藻粉，加入100 mL pH 7.0 0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，搅拌均匀后反复冻融3次。将破碎的螺旋藻细胞悬浊液经离心机离心20 min，转速为4 000 r/min，获得藻蓝蛋白粗提液;(2)将CTAB以体积比为1∶4的比例溶于正辛烷和正戊醇的混合液中，并用磷酸盐缓冲液洗涤2～3次 ，得到透明澄清的CTAB反胶团溶液;(3)反胶团溶液和藻蓝蛋白粗提液等体积加入到10 mL具塞离心管 ，以60次/min的频率，恒温25℃上下颠倒离心管10 min，静置分层，移取水相;(4)向离心管中加入与上相等体积的pH 7.0 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(含0.1 mol/L KCl)溶液 ，恒温25℃，以60次/min的频率上下颠倒离心管2 h，静置分层，移取水相，水相即为反胶团反萃取液。

反胶团萃取技术在富集分离生物活性物质上具有以下优势:(1)选择性好、分离效率高;(2)分离速度快，具有提纯和浓缩作用;(3)分离条件温和，保持生物物质高活性;(4)正萃和反萃同时进行，分离料液处理简单，易放大，操作方便。

3 膜分离技术

膜分离技术被认为是对传统化学分离方法的一次革命，其利用天然或人工合成的、具有选择透过性的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，实现对双组分或多组分的溶质和溶剂选择性分离的技术［22］。纯化分离所采用的膜主要是超/微滤膜，由于其所能截留的物质粒径大小分布范围广，被广泛应用于固液分离、大小分子物质的分离、脱除色素、产品提纯、油水分离等工艺过程中。

Jaouen等［23］用膜分离技术对螺旋藻的藻蓝蛋白提取液进行纯化和浓缩。具体操作流程为:(1)Zarrouk培养基培养的螺旋藻收获后用灭过菌的去离子水清洗，藻体悬浊液在－35℃进行冻融，最后用超声波处理;(2)采用有机管膜的纳滤膜MT03，其截通分子质量为500Da，膜面积为0.05 m2/module，控制进料压力为30×105Pa，切线流速为1.5 m/s，对上述样品进行处理，得到藻蓝蛋白的回收率为100%，浓缩因子达到7。Chaiklahan等［24］采用超微滤膜的方法处理藻蓝蛋白粗提液，得到了食品级藻蓝蛋白，其操作流程为:(1)新鲜的螺旋藻按照1∶100的比例加入磷酸盐缓冲液，用浆轮不断搅拌4h，转速为300 r/min;(2)悬浊液离心15 min，离心力为4 800×g，去除细胞碎片，得到藻蓝蛋白粗提液;(3)采用膜孔径为5um的滤膜，按照流速为150 mL/min，渗透通量为58.5L/(h·m2)的处理条件对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，藻蓝蛋白的回收率为88.6%;以膜孔径为0.8/0.2um的滤膜，采用流速为100 mL/min，渗透通量为336L/(h·m2)的处理条件对粗过滤得到的滤液进行精过滤，藻蓝蛋白的回收率为82.9%;(4)采用截通分子质量为50 kDa，平均渗透量为26.8L/(h·m2)的滤膜，按照压强为69kPa，流速为75 mL/min的处理条件对精过滤得到的滤液进行超滤。经过这几步处理，藻蓝蛋白的纯度达到1.0左右，即达到食品级要求。

超/微滤膜过滤与传统过滤的不同在于不同分子质量的化合物可通过膜进行有效分离，这个过程是一种物理过程，不发生相的变化，不需要添加助剂。采用膜进行分离纯化的优点［25－26］:(1)分离效果好，过滤分离回收率高，产品质量高，运行成本低;(2)过程无需添加化学药品、溶媒溶剂，不带入二次污染物质;(3)设备可自动运行，稳定性好，容易实现工业化扩产需求。

4 扩张床吸附技术

扩张床吸附(expanded bed absorption，EBA)技术是20世纪90年代开发的一种新型生化分离技术［27］，最大特点是可以从含有固体生物质颗粒(如细胞、细胞碎片)的料液中直接捕获目标物，集固液分离、浓缩和初期纯化于一个单元操作之中，可以缩短分离步骤，减少活性物质损失，提高产品收率，节省分离成本，而且获得的高浓度、高纯度的粗提液可直接用于下一步的纯化操作，体现了生物分离过程的集成化优势［28］。

Ramos等［29］采用扩张床吸附技术大规模纯化水生集胞藻藻蓝蛋白，技术流程如下:通过渗透冲击法(pH 7.0、50 mmol/L磷酸钠缓冲液，浸提3次)破碎水生集胞藻细胞壁，离心获得上清液(A615/A280为0.7)，流经 EBAC(吸附剂为 Streamline-DEAE，柱内径15 mm;最优参数为:吸附量4.9 mg/mL吸附剂，扩张床体积为固定床的2倍，进样液黏度1.020 mPa，pH 7.0、500 mmol/L 磷酸钠缓冲液洗脱)，此步骤藻蓝蛋白回收率为91%;富含藻蓝蛋白的洗脱液(A615/A280为2.61)经透析后再经DEAE阴离子交换层析柱纯化(吸附剂为DE-52，柱2.5 cm×20 cm，pH 7.0、290 mmol/L磷酸钠缓冲液洗脱，流速50 mL/h)进行纯化，此纯化步骤藻蓝蛋白回收率为76%，A615/A280大于4.0;最终藻蓝蛋白回收率为69%，向富含藻蓝蛋白的洗脱液添加硫酸铵至饱和度为70%，4℃静置12 h，离心，沉淀复溶于5 mmol/L磷酸钠缓冲液中，4℃透析过夜，真空冷冻干燥成粉。Bermejo R等［30］采用1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.0)浸泡螺旋藻，然后离心获得藻蓝蛋白粗提液，经透析后进而经装填有阴离子交换树脂Streamline-DEAE的扩张床吸附柱纯化，洗脱收集藻蓝蛋白纯度(A620/A280)大于2.0的洗脱液，回收率为80%;收集到的富含藻蓝蛋白洗脱液透析后再经Sephadex G-100凝胶过滤层析色谱纯化，收集藻蓝蛋白洗脱液;向藻蓝蛋白洗脱液中添加硫酸铵至饱和度为70%，离心后收集沉淀，沉淀复溶后透析，经DEAE-52离子交换层析柱纯化，藻蓝蛋白洗脱液经透析后，冷冻干燥成粉，最终藻蓝蛋白的得率为9.6%。Niu等［13］采用扩张床吸附技术从劣质的螺旋藻粉中制备藻蓝蛋白，其工艺流程为:采用0.5mol/L浓度的硫酸铵浸泡螺旋藻粉，经离心获得藻蓝蛋白粗提液;藻蓝蛋白粗提液经填充Phenyl-sepharose柱料的扩张床色谱纯化后，洗脱液中藻蓝蛋白纯度(A620/A280)达2.87;纯度(A620/A280)为2.87的藻蓝蛋白溶液透析后再经Q-sepharose离子交换层析柱纯化，收集藻蓝蛋白纯度(A620/A280)大于3.2的洗脱液，其余部分洗脱液透析后经羟基磷灰石柱层析纯化，收集纯度(A620/A280)大于3.2的藻蓝蛋白洗脱液;最终汇总纯度(A620/A280)大于3.2的藻蓝蛋白溶液，经透析后冷冻干燥成干粉，回收率为13.7%。Ramos等［31］利用扩张床吸附色谱技术提取鱼腥藻冻干粉中的藻蓝蛋白，其流程为:按照1∶20的料液比获得藻粉悬浮体系，常温磁力搅拌，离心，获得藻蓝蛋白粗提液;藻蓝蛋白粗提液经Streamline-DEAE扩张床吸附色谱柱纯化后，收集富含藻蓝蛋白的洗脱液;藻蓝蛋白洗脱液经硫酸铵沉淀、复溶、透析，再经DEAE-52阴离子交换层析色谱柱纯化，收集富含藻蓝蛋白洗脱液;向藻蓝蛋白洗脱液中添加硫酸铵至饱和度为70%，4℃黑暗条件静置过夜，离心，沉淀复溶于磷酸盐缓冲液，再经透析得到藻蓝蛋白溶液，最终藻蓝蛋白回收率为62%，溶液冷冻干燥为藻蓝蛋白粉。

5 展望

藻蓝蛋白作为荧光探针可用于细胞及大分子标记，作为天然色素可用于食品及化妆品行业，其具有抗氧化、抗癌活性，可作为治疗药物用于医药领域。虽然藻蓝蛋白有诸多用途，但高昂的纯化制备费用限制了藻蓝蛋白的广泛应用。传统的藻蓝蛋白纯化流程包括很多单元操作，如沉淀、离心、透析、离子交换色谱层析、凝胶过滤色谱层析、羟基磷灰石色谱层析等。一般来说，传统的藻蓝蛋白制备方法主要包括2个过程:(1)样品的预处理，释放细胞内物质，获得粗提液;(2)应用传统色谱技术纯化藻蓝蛋白。样品前处理主要目的是破碎细胞，方法有超声波破碎、酶解、冻融、机械破碎、利凡诺处理、吐温X-100处理、丙酮处理等。其中，冻融、渗透冲击、超声波破碎是实验室常用的细胞破壁方法。高压细胞破碎技术及珠磨破碎技术破壁效率高，在工业上应用较多。细胞破壁后，经固液分离获得粗提液。第二步涉及到多种色谱层析的综合利用，包括疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析。这些传统方法的一大弊端在于步骤繁琐，目的产物损失较大，成本较高，耗时长，很难规模化操作。提高细胞破壁效果，减少纯化步骤，提高产品的纯度和收率是藻蓝蛋白规模化生产的关键。本文综述了近几年发展较快的几种高效、经济、适合规模化制备的生物分离方法，并结合本实验室的工作，现提出一种规模化制备藻蓝蛋白的方案(图1)。该方案采用高压细胞破碎技术处理样品，处理后的溶液流经扩张床吸附层析柱，洗脱得到藻蓝蛋白富集液;然后用藻蓝蛋白富集液与PEG、盐配制双水相体系，吸取藻蓝蛋白所在液相液体后经超滤处理，得到的溶液冻干成藻蓝蛋白粉。

图1 规模化制备藻蓝蛋白的方案Fig.1 Scheme of the production of phycocyanin in large scale

我国螺旋藻干粉年产量近万吨，超过全球总产量的50%，这为藻蓝蛋白的大规模生产提供了原料支持。目前我国螺旋藻产业以销售螺旋藻原粉、胶囊、片剂为主，产品深加工程度低。以螺旋藻为原料，提取制备藻蓝蛋白以及其他活性成分，增加产品附加值，丰富产品种类，促使产业结构转型升级是摆在政府工作者、企业家以及科研工作者面前的具有重大创新意义及经济价值的课题。

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