海洋低温β-半乳糖苷酶菌株筛选、鉴定及酶的分离纯化

崔爱萍，迟乃玉，张庆芳

1(大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连，116622)2(辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁大连，116622)

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)常简称为乳糖酶，广泛存在于植物、动物和微生物中。此酶最初主要应用于乳品工业中将转化乳糖为单糖，生产低乳糖奶，以缓解乳糖不耐症［1］。目前可以用于制备低聚半乳糖，在食品工业用于饮料、冰淇淋、糖果、奶粉、口服液等［2－4］，还可以作为肠道内双歧杆菌的增殖因子［5－7］，有效提高人体各项机能。

在低温条件下，低温酶仍具有较高酶活，相较中高温酶该低温酶制剂可以降低生产成本，减少工艺流程，提高生产效率，增加经济效益，改善产品质量。低温β-半乳糖苷酶大多是由低温微生物产生，它们主要分布在极端环境中并经过长期驯化。目前已经从南极［8－12］、日本北海道［13］等地分离到产低温 β-半乳糖苷酶的菌株，研究发现大多数低温β-半乳糖苷酶产生菌为假交替单胞菌和节杆菌属的菌株。筛选得到的菌株为土生拉乌尔菌，目前还未见有关该菌产β-半乳糖苷酶的报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品由国家海洋环境检测中心采自黄海海域123.396°E，36.701 4°N，深度 6 ～50 m 海泥。

ONPG(邻硝基苯-β-D-半乳糖苷)、x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷)购自上海生工，其余均为国产分析纯。

富集培养基:乳糖 20 g，NaCl 5 g，蒸馏水 1 L，pH 7.0;1 ×105Pa，121℃灭菌30 min。

平板筛选培养基:乳糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 L，pH7.0;1 ×105Pa，121℃灭菌30 min，暗处涂布浓度为20 mg/mL的 x-gal溶液［14］。

平板活化培养基:乳糖20 g，蛋白胨10 g，NaCl g，蒸馏水1 L，pH 7.0;1 ×105Pa，121℃灭菌30 min。

种子培养基:乳糖20 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水 1L，pH 7.0;1 ×105Pa，121℃灭菌 30 min。

发酵培养基:乳糖20 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水 1L，pH 7.0;1 ×105Pa，121℃灭菌 30 min。

菌种保藏培养基:牛肉膏20 g，酵母膏10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1L，pH 7.0;1 ×105Pa，121℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

UV-1200型紫外可见分光光度计(配有宽波长高精度AD转换器)，上海美谱达仪器有限公司;JY98-3D超声波细胞粉碎机(配有不同功率变幅操作系统)，宁波新芝生物科技有限公司;HD-4电脑核酸蛋白检测仪(配有254、280 nm数显和80 μL数显)，上海沪西分析仪器有限公司;CBS-B程控多功能自动部份收集器(配有微处理器控制和多容量收集装置)，上海沪西分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株筛选

10 g海泥，90 mL无菌水，加入乳糖作为唯一碳源，20℃低温振荡培养30 h，无菌水对富集上清液进行梯度稀释，均匀涂布到含有x-gal的平板筛选培养基上，20℃培养30 h。挑取显蓝色菌落(如无蓝色显示，4℃隔夜放置)，在无x-gal的平板筛选培养基继续划线纯化，分别挑取单菌落接种于液体培养基20℃振荡培养30 h，测定β-半乳糖苷酶活性并筛选酶活最高的菌株。

1.3.2 β-半乳糖苷酶粗酶液的制备

取发酵液4℃离心(6 000 r/min)30 min，pH7.0磷酸缓冲液冲洗，离心，重复2次，离心，加pH7.0磷酸缓冲液至与发酵液相同体积，冰水浴超声处理(500 W，工作 1 s，间歇2 s，10 min)，4℃离心(8 000 r/min)30 min，得到上清液，即为β-半乳糖苷酶粗酶液。

1.3.3 β-半乳糖苷酶酶活测定方法

β-半乳糖苷酶粗酶液用pH 7.0磷酸缓冲液适当稀释，取0.5 mL稀释粗酶液加入1.5 mL0.25%邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(oNPG)，25℃反应10 min，加入2 mL.1 mol/L NaCO3终止反应。测420 nm处吸光值，计算酶活力。对照组为加入oNPG和NaCO3，最后加粗酶液。

酶活力定义:按照β-半乳糖苷酶酶活力测定方法，每分钟分解ONPG生成1 μmol oNP的酶量为1个酶活单位(U)。

1.3.4 菌种鉴定方法

1.3.4.1 形态学观察

在平板培养基上观察菌落形状、颜色、大小等形态学特征，通过不同染色方法在光学显微镜(10×100)下观察菌体形态。

1.3.4.2 生理生化鉴定方法

参照《常见细菌系统鉴定手册》(2001年)相关内容，对该菌种进行苯丙氨酸脱氢实验、H2S实验、乳糖水解实验、柠檬酸盐实验、吲哚试验、V-P实验、尿素水解实验、赖氨酸脱羧酶实验。

1.3.4.3 分子生物学鉴定方法

采用酚氯仿抽提法提取菌株DNA。应用16S rDNA两端保守区域设计引物:Forward primer P1(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)和 Revese primer P2(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)进行 PCR 扩增。扩增反应体系 Ex Taq(5 U/μL)0.25 μL，Buffer 5.0 μL，dNTP mixture 5.0 μL，P1 primer 1.0 μL，P2 primer 1.0 μL，补加 ddH2O 至 50 μL。扩增反应条件为 94℃预变性5 min，1个循环;94℃变性1 min，55℃复性1 min，72℃延伸1.5 min，进行30个循环;最后72℃延伸5 min，1个循环。PCR得到的扩增产物送交大连宝生物工程有限公司测序。得到含有1 492 bp的16S rDNA核苷酸序列，登陆NCBI，输入GenBank数据库进行blast比对，获取与其核酸序列相似度高的菌种。采用MEGA5软件进行多序列匹配比对，计算相近序列之间的进化距离，利用Neighbor-Joining构建系统发育树。

1.3.5 酶分离纯化

1.3.5.1 (NH4)2SO4分级沉淀

在粗酶液中加入饱和度为10%～80%的(NH4)2SO4溶液，4℃盐析12 h，蛋白沉淀用 pH 7.0磷酸缓冲液溶解，分别测定每个梯度盐析得到的沉淀酶活，最后收集含有酶活性的蛋白沉淀溶解进行后续实验。

1.3.5.2 透析和超滤

(NH4)2SO4沉淀溶解得到的酶液装入预先处理好的透析袋中，4℃透析，用硝酸盐溶液检测透析袋外液无沉淀产生除去NaCl，并同时除去小分子物质和金属离子。将透析完成的样品转入截留分子量为10 kDa，经过预处理的超滤管超滤，4℃，5 000 r/min离心30 min，移液枪小心取出浓缩液，4℃保藏备用，取部分溶于磷酸缓冲液，计算回收率。

1.3.5.3 Sephadex-G100柱层析

利用具有多孔网状结构的凝胶颗粒的分子筛作用，根据分离样品中分子质量大小的差异进行洗脱分离的一项技术。按照分子在层析凝胶中的保留时间长短逐步洗脱。

取5 mL超滤后酶液加入预先用pH 7.0磷酸缓冲液平衡过的Sephadex G100凝胶柱(φ1.6 cm×50 cm)，调节恒流泵洗脱速度控制在0.3 mL/min。调节自动收集器，每管收集3 mL，根据显示器的洗脱峰记录试管号，分别测定每管酶活。

1.3.5.4 SDS-PAGE电泳

采用SDS-PAGE鉴定酶的纯化程度，用考马斯亮蓝染色法确定电泳条带的位置。SDS蛋白质复合物长度与其分子量成正比，电泳迁移率主要取决于分子量的大小。电泳结束后，染色、脱色，若得到单一条带，即为纯化的β-半乳糖苷酶。

电泳指标:分离胶12%，浓缩胶5%，电压100 V，1.5 mm梳，时间2 h，考马斯亮蓝R250染色。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

平板分离纯化得到7株能分解x-gal使菌落显蓝色的菌株。由菌落表面特征初步判断均为细菌，分别命名CD1～CD7。

对CD1～CD7分别进行液体摇瓶发酵20℃30 h，利用β-半乳糖苷酶酶活测定方法分别测定7菌株的酶活，筛选酶活最高的菌株CD6作为实验的出发菌种。酶活结果见表1。

表1 菌株酶活比较Table 1 Enzymatic activity comparison of different strains

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态学特征

由图1、图2可知，菌株CD6在平板培养基上菌落为圆形，边缘整齐，乳白色，表面光滑，湿润，半透明，鼻涕状，黏稠，在培养基上易成片存在，用接种环易挑取。镜检革兰氏染色阴性，杆状，末端钝圆，有荚膜无芽孢。

图1 菌株CD6菌落形态图Fig.1 The colony morphology of strain CD6

图2 菌株CD6显微形态特征Fig.2 The micro-morphology of strain CD6

2.2.2 生理生化特征

按照《常见细菌系统鉴定手册》(2001)关于革兰氏阴性杆菌的相关检索内容，对菌株CD6的生理生化特征进行检验和测定，实验结果见表2。

表2 菌株CD6生理生化特征Table 2 Traditional taxonomical properties of strain CD6

2.2.3 菌株16S rDNA鉴定

进行PCR扩增，扩增产物经过测序得到CD6菌株16S rDNA全序列，长1 492bp，其序列如下:

5'-AATTTCACACAGGAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAGGAAGGCGATAAGGTTAATAACCTTAGTGATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGG-3'

将所得序列输入GenBank数据库进行Blast同源性比对，Raoultella terrigena(NR 037085.1)与CD6相似性达到99.59%。由上述形态学及生理生化特征实验将CD6初步确定为Raoultella terrigena。采用MEGA5软件计算相似序列之间的系统进化距离并构建系统发育树(图3)，结果表明二者同源性可靠程度为95%，可以确定菌株 CD6为 Raoultella terrigena。如图该菌种属于拉乌尔菌属，通过核酸测序、生理生化及DNA杂交技术于2001年建立的新属。

图3 菌株CD6系统发育进化树Fig.3 Phylogenetic tree showing the relationships of CD6 with the sequence of relating type

2.3 酶分离纯化

粗酶液经(NH4)2SO4盐析得到的蛋白沉淀均无活性，说明(NH4)2SO4分级沉淀对该酶影响很大，因此粗酶液直接进行透析、超滤除杂浓缩。浓缩液经Sephadex G100凝胶柱层析，结果如图4所示。在整个洗脱过程共出现3个峰，分别测定各管酶活，发现β-半乳糖苷酶主要集中在第1个蛋白峰内。说明经过Sephadex G100凝胶柱层析除去了一部分小于其分子量的蛋白。

图4 Sephadex-G100凝胶柱层析洗脱结果Fig.4 The eluting result of sephadex-G100 column chromatography

粗酶液经过透析、超滤、Sephadex-G100层析处理后，由图可知，低温 β-半乳糖苷酶回收率达到了33.77%，比活力提高了近4倍。

2.4 SDS-PAGE电泳结果

经过每一步分离纯化处理的酶液进行SDSPAGE电泳，得到的电泳结果如图5所示。粗酶液经过透析、超滤、Sephadex-G100层析处理后电泳得到了单一条带，说明纯化效果较好。根据相对迁移率分子量的关系，可以计算出该低温β-半乳糖苷酶的分子量为30.8 kDa。

表3 低温β-半乳糖苷酶纯化结果Table 3 The result of isolation and purification

图5 酶液SDS-PAGE电泳结果Fig.5 SDS-PAGE of enzyme solution at different stages of purification

2.5 酶最适温度确定

由图6可知，酶的最适作用温度为20℃;30℃剩余相对酶活85%;超过35℃酶活力即迅速下降。

图6 反应温度对酶活的影响Fig.6 The effect of temperature on relative activity

3 结论

低温微生物多来自极端低温环境，但其产酶不一定为低温酶。本文筛选的菌株CD6来自渤海海泥，经鉴定为土生拉乌尔菌，目前没有关于利用该菌生产β-半乳糖苷酶的报道。经过透析、超滤、Sephadex-G100层析处理就可以完成低温β-半乳糖苷酶的分离纯化，分子量30.8kDa，纯化效果良好。批次生产低乳糖制品多是在10℃以下完成乳糖水解，菌株CD6低温条件下生长良好，产β-半乳糖苷酶的最适温度为20℃，10℃下相对酶活39%，可用于低乳糖奶制品生产。

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