鱼油纳米脂质体的制备及其性质测定*

涂宗财，张朋，王辉，尹月斌，满泽洲

1(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌，330047)2(江西师范大学生命科学学院，江西南昌，330022)

鱼油因其富含ω-3型多不饱和脂肪酸而成为一种重要的功能食品，比如α-亚麻酸(C18:3n-3)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。临床研究已经证实，ω-3型脂肪酸有促进大脑发育、降低患心血管疾病的风险、抗炎抗肿瘤等生理作用［1-3］。然而，由于ω-3型脂肪酸极易发生氧化，这给它的功能性作用带来了较大影响。运用微胶囊化技术能够有效提高鱼油的氧化稳定性和贮藏时间，同时微胶囊的缓释作用可以提高其消化吸收利用率［4］。

脂质体是微胶囊技术向纵深的发展，通常指由磷脂构成的双层膜球形小泡，可以包埋亲水性、亲脂性或两亲性的药物、营养因子［5］。作为一种载体，其优点有:可以同时包埋亲水性和疏水性物质，在水中的分散性较好;主要壁材磷脂是生物膜的组成成分之一，生物相容性好，毒性小，安全性高;能够保护被包埋物质，并起到缓释作用［6］。目前，脂质体技术已经在医药领域得到成熟应用，近年来已有学者关注其在功能食品领域的应用，主要包括了对中链脂肪酸、抗氧化、抗菌活性成分和维生素等物质的包埋［7-9］。脂质体的制备方法比较多，常见的有薄膜分散法［10］，乙醇注入法［11-12］，逆向蒸发法［13］，冻融法［14］等，这些方法或多或少存在产品粒径较大、稳定性差、有毒有害溶剂残留等缺点。基于这些原因，为了使脂质体技术能在食品领域安全、规模化的应用，对传统制备方法进行改进将具有重要意义。

动态高压微射流技术使流体在振荡头中达到300 m/s以上的速度分成2股或更多股细流，然后在极小空间进行强烈的垂直撞击或Y型撞击，在撞击的过程中瞬间释放出其大部分能量，产生巨大的压力降，从而使得液体颗粒高度破碎，能有效降低流体中固体颗粒的粒径，并且可以实现连续化生产［15］。目前，还未见将乙醇注入法和动态高压微射流技术相结合制备脂质体的报道，本研究运用乙醇注入-动态高压微射流法制备鱼油纳米脂质体，优化了其制备工艺，并对鱼油纳米脂质体的储存稳定性进行了初步研究;避免了有毒有害溶剂的使用，有效的降低了脂质体的平均粒径和多分散指数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼油，南京森海生物油脂厂，EPA+DHA＞30%;卵磷脂、胆固醇，上海蓝季科技发展有限公司;吐温-80，天津市大茂化学试剂厂;甲醇、无水乙醇、正己烷、石油醚(沸程60～90)，均为分析纯;磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 6.8，0.05 mol/L)。

1.2 仪器与设备

V-1001旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司;Microfluidizer Processor M-110EH微射流仪，美国Microfluidics公司;NICOMP380/ZLS纳米粒度分析仪，美国PSS粒度分析仪公司;TGL-10C高速离心机，上海安亭科学仪器厂;UV-2450紫外分光光度计，日本岛津公司;H-600透射电镜，日本日立公司;JD200-3B电子分析天平，沈阳龙腾电子有限公司;透析袋(14 000D)国药集团化学试剂有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 乙醇注入-动态高压微射流法制备鱼油纳米脂质体

将类脂材料(大豆卵磷脂、胆固醇和鱼油)以一定比例溶解于无水乙醇中，然后用注射器将其注入到溶有一定量吐温-80的pH 6.8的 PBS缓冲液中，在40℃条件下，利用旋转蒸发仪使悬浮液中乙醇完全挥发，即得到粗脂质体［11-12］。将粗脂质体用动态高压微射流仪在不同压力条件下处理不同次数，即可得到鱼油纳米脂质体。运用同样的方法在不添加鱼油的条件下制备空白脂质体。

1.3.2 鱼油纳米脂质体包封率的测定

1.3.2.1 吸收波长的确定

将鱼油、胆固醇和磷脂分别溶解在石油醚中配成0.6 mg/mL的溶液，取适量上述3种溶液分别放入比色皿中，以石油醚为空白对照，用UV-2450紫外分光光度计在200～400 nm波长处分别扫描3种溶液。

1.3.2.2 标准曲线的绘制

配制一系列不同浓度鱼油石油醚溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)，以石油醚为空白，在1.3.2.1测得的最佳波长处测定鱼油石油醚溶液的吸光度，以鱼油的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2.3 鱼油纳米脂质体包封率的测定

取20 mL脂质体于透析袋中透析16 h除去游离鱼油，精密量取10 mL透析内液，选用甲醇为破乳剂，用超声破壁(30 min，功率100 W)，加入石油醚提取，于4 000 r/min离心6 min，取上清液于容量瓶中用石油醚定容，在1.3.2.1测得的最佳波长处测定其吸光度，鱼油脂质体吸光度为A，空白脂质体吸光度为A0，计算 ΔA(ΔA=A-A0)，根据 1.3.2.2 得到的线性回归方程求出包封的鱼油质量［16-17］;由公式(1)计算得出包封率。

1.3.3 乙醇注入-动态高压微射流法制备鱼油纳米脂质体的工艺优化

以包封率为指标，影响鱼油纳米脂质体包封率的因素较多，对各个单因素做了考察，脂质浓度(10、20、30 、40、50、60 mg/mL)，磷脂与胆固醇质量比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)，磷脂与鱼油的质量比(20∶1、10∶1、10∶2、10∶3、10∶4)，磷脂与吐温-80 的质量比(20∶1、15∶1、10∶1、10∶2、10∶3)，微射流压力(80、100、120、140、160 MPa)，微射流次数(0、1、2、3、4、5)。在单因素实验的基础上，通过极差分析，选取了磷脂浓度、磷脂与鱼油的质量比、微射流处理压力、微射流处理次数4个对包封率影响较显著的因素，采用四因素三水平的响应面分析方法求取最佳工艺参数，实验因素与水平设计见表1。

表1 实验因素水平及编码Tabel 1 Codes and levels of factors chosen for the trials

1.3.4 鱼油纳米脂质体粒径和Zeta电位的测定

用Nicomp380/ZLS纳米激光粒度分析仪测定。将最佳工艺制备的纳米脂质体悬浮液稀释一定倍数，测定平均粒径和Zeta电位，样品平行测定3次。

1.3.5 鱼油纳米脂质体的形貌观察

运用负染色法对脂质体悬浮液进行透射电镜观察:用蒸馏水将脂质体样品稀释到大约10 mg/mL，将稀释后的样品与20 g/L磷钨酸以体积比1∶1混合放置2～3 min，将铜网浸入上述液体，并用滤纸吸干多余液体，待自然晾干后，在放大倍率60 000×，工作电压为75kV的透射电镜下观察鱼油纳米脂质体的形态［18］。

1.3.6 鱼油纳米脂质体稳定性考察

取最佳工艺条件制备的鱼油纳米脂质体，分别储存在-18、4和25℃条件下，考察其包封率和粒径随储存时间的变化趋势。

2 结果与分析

2.1 最佳吸收波长的选择和标准曲线的绘制

如图1所示，虽然在吸收波长为214 nm处，鱼油石油醚溶液有最大吸收峰，但磷脂、胆固醇石油醚溶液在此处也有较强吸收;在274 nm处鱼油石油醚溶液有较大吸收峰，磷脂、胆固醇石油醚溶液吸收峰较弱，因此选择274 nm作为测定鱼油纳米脂质体包封率的吸收波长。在此波长下，按照1.3.2.2的方法得到鱼油石油醚溶液的线性回归方程为A=1.197X+0.031 9，R2=0.997 4。

图1 鱼油、磷脂、胆固醇石油醚溶液的紫外扫描曲线Fig.1 Ultraviolet scanning spectrum of fish oil、soybean phosphatidylcholine and cholesterol

2.2 响应面优化实验结果

进行Box-Behnken的四因素三水平实验设计，对实验数据进行回归性分析，建立数学模型，得到制备鱼油纳米脂质体的最佳工艺条件。响应面实验设计方案与实验结果见表2。

表2 响应面实验设计与实验结果Table 2 Response surface design and test results

2.3 模型的建立及显著性分析

对表2中的数据进行多元回归拟合，得到磷脂浓度(A)、磷脂与鱼油的质量比(B)、微射流压力(C)、微射流处理次数(D)与包封率(Y)之间的二次多项回归方程:Y=72.5+2.95A+3.47B+11.54C+1.50D-1.20 AB+1.30AC+0.05AD-1.22BC+0.55BD-0.10CD-4.52A2-7.91B2-7.21C2-5.92D2。对该回归模型进行方差分析，结果见表3。

根据统计学知识对方差表进行分析，回归方程模型P值＜0.000 1，说明所选用的二次多项模型高度显著;模型相关系数R2=0.972 8，仅有2.3%的响应值总变异不能由此模型解释，说明该模型能较好地描述实验结果;实验失拟项不显著，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析;变异系数(CV)为3.7%，说明实验有良好的稳定性;综合分析说明可以用此模型来分析和预测乙醇注入—动态高压微射流法制备鱼油纳米脂质体的工艺结果。模型一次项 A、B、C、D 和二次项 A2、B2、C2、D2差异都是显著的，说明所选因素与响应值两者不是简单的线性关系。F值可以反映各因素对实验指标的重要性，F值越大，表明对实验指标的影响越大［19］，由表3可知各因素的主次顺序为:微射流压力＞磷脂与鱼油的质量比＞磷脂浓度＞微射流处理次数。

2.4 响应曲面分析及最优条件的确定

响应曲面越陡峭，表明操作条件对响应值的影响越显著;等高线趋于椭圆则反映2个因素交互作用显著。如图2-C中曲面陡峭程度最大，表明微射流处理压力、鱼油与磷脂质量比这2个因素对包封率的影响比较大，这与单因素的实验结果一致;图2-A中等高线呈明显的椭圆形，表明磷脂浓度和鱼油与磷脂质量比这2个因素交互作用明显。

根据所得模型，预测最优工艺条件为:磷脂浓度29.1 mg/mL，磷脂和鱼油质量比 10∶2.2，微射流压力152.5 MPa，微射流次数2.1次，在此条件下包封率的理论值为77.8%。考虑到实际操作的便利，将工艺参数修正为:磷脂浓度29 mg/mL，磷脂和鱼油质量比10∶2，微射流压力150 MPa，微射流处理次数2次，在此条件下进行3次重复实验，得到平均包封率为76.9%，与理论预测值相比，其相对误差约为1.2%，说明响应面优化得到的实验参数具有一定的实用价值。

表3 回归模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

图2 不同因素交互作用对鱼油纳米脂质体包封率的影响Fig.2 Response surface plots showing the pairwise interactive effects of different conditions on encapsulation efficiency of fish oil nanoliposomes

2.5 鱼油纳米脂质体粒径与Zeta电位

粒径分布通常作为衡量纳米脂质体稳定性的一个重要指标，由图3得知，最佳工艺条件下脂质体的平均粒径为 128.1 nm，多分散指数(PDI)为 0.258。在相同配方条件下，未经过动态高压微射流处理的脂质体的平均粒径为 442.6 nm，PDI 0.901。PDI值越小，表明粒径分布范围越狭窄，粒度的均匀性也越好;脂质体的Zeta电位为-20.11 mV，Zeta电位大意味着脂质体双分子膜表面带有的电荷越多，聚集时需要克服的静电斥力就越大，较大的Zeta电位可以阻碍脂质体溶液中的微粒发生凝聚［11，18］。因此，根据粒径、PDI和Zeta电位的测定结果可以初步预测鱼油纳米脂质体具有较好的稳定性。

图3 鱼油纳米脂质体的粒径分布图和Zeta电位Fig.3 Diameter distribution and Zeta potential of fish oil nanoliposomes

2.6 鱼油纳米脂质体的形貌观察

透射电镜观察表明乙醇注入—动态高压微射流法制备的鱼油纳米脂质体为球形或椭球形，外观平滑完整，无明显塌陷和凝聚成团，颗粒分布较均匀。

图4 鱼油纳米脂质体的透射电镜图Fig.4 TEM micrograph of fish oil nanoliposomes

2.7 不同储存温度下鱼油纳米脂质体稳定性考察

由图5可知，鱼油纳米脂质体在25℃储存条件下粒径随时间延长显著增大，发生了聚集，包封率显著降低，鱼油出现了泄漏情况，这可能是因为高温条件下磷脂氧化加剧，造成脂质双分子层结构出现了破损，从而使鱼油渗漏。条件为-18℃时，在第1周内脂质体的包封率降低较明显，这主要是因为冰晶的形成和升华破坏了磷脂的膜结构，因此在将脂质体溶液进行冻干时，有必要添加一定量的冻干保护剂［20］。4℃时脂质体粒径和包封率变化较小，表明在该条件下脂质体具有较好的稳定性。

3 结论

(1)利用乙醇注入-动态高压微射流法制备鱼油纳米脂质体的最佳工艺条件为:磷脂浓度29 mg/mL，磷脂与胆固醇质量比4∶1，磷脂与吐温-80的质量比10∶1，磷脂和鱼油质量比 10∶2，微射流压力 150 MPa，微射流处理次数2次，在此条件下脂质体的包封率为76.9%。

(2)在最佳工艺条件下脂质体的平均粒径为128.1 nm，多 分 散 指 数 (PDI)0.258，Zeta 电 位-20.11 mV。透射电镜观察到脂质体为球形或椭球形，外观平滑完整。在4℃储存条件下脂质体具有较好的稳定性。

图5 不同储存温度条件下粒径和包封率随时间的变化趋势Fig.5 The changing trends of particle size and encapsulation efficiency with various times under the conditions of different storage temperatures

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