花椰菜游离小孢子培养研究进展

边立娜　牛国保　孙德岭

摘 要：综述了利用小孢子培养技术创新花椰菜种质资源的研究及进展、胚胎发生的影响因素及前景展望。

关键词：花椰菜；小孢子培养；种质创新

中图分类号：S635.3 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.06.002

花椰菜（Brassica oleracea var. botrytis L.）在我国栽培历史较短，十九世纪中叶传入我国南方，其种质资源是国家和人民的宝贵财富，是培育优良品种不可缺少的物质基础，也是生物学理论研究的重要材料。随着现代科学技术与我国蔬菜产业的发展，花椰菜种植面积快速增长，品种需求量急剧增加，从自然形成的品种中进行选育的方法已经远远不能满足现代农业的需求。因此，加快花椰菜新品种选育、提高育种技术、创新种质资源是花椰菜育种工作的当务之急[1-3]。笔者仅就利用小孢子培养技术创新花椰菜种质资源的研究及进展作一简单介绍。

1 创新花椰菜种质资源的重要性与迫切性

花椰菜种质资源系统性的整理、评价、鉴定工作在我国还处于初级阶段，花椰菜育种研究薄弱，这是因为我国关于花椰菜的研究起步较晚，而且从事花椰菜育种研究的单位较少，研究力量薄弱，与其他蔬菜育种相比存在一定距离。

我国花椰菜种质资源主要集中分布在福建省、浙江省、广东省及上海市，由于种植地比较集中，种质资源遗传背景狭窄，花椰菜品种单一、品种间遗传相似性高[1，4]。因此，在花椰菜育种工作中，创新种质资源，选育出适应不同栽培环境及市场需求的新品种是十分迫切的。

2 小孢子培养技术在花椰菜种质创新中的应用

小孢子培养技术应用于花椰菜种质创新的优越性体现在3个方面。

（1）可以得到高度纯合、稳定的亲本。游离小孢子培养是将花粉培育成单倍体植株，其染色体是自然或人工加倍得到纯合二倍体的一种育种方法。这种染色体加倍产生的纯合二倍体，在遗传上非常稳定，不发生性状分离，形成性状稳定一致的近等基因系，为遗传育种研究提供良好的育种材料[4-5]。同时，高纯度的植株更便于遗传分析、遗传图谱的构建和分子标记等基础研究。

（2）应用这一技术，能缩短育种年限，加速育种进程。常规的亲本获得途径是通过自花授粉和定向选择，需经6～8代，时间长，花椰菜多为自交亲和。而通过小孢子培养获得稳定的材料，进一步用于育种实践，大大缩短了育种年限[4]。

（3）可提高诱变育种的效率[5]。在诱变育种中，基因突变的机率很低，如果突变的是一个隐性基因，植株上不能直接表现出来，而以单倍体植物作诱变材料，突变隐性基因就可表现出来。所以利用单倍体植株的突变能够筛选抗病、抗虫、抗旱的高产花椰菜植株。

3 影响花椰菜小孢子胚胎发生因素的研究

3.1 不同花椰菜基因型对胚胎诱导的影响

基因型是影响小孢子培养的最关键因素。不同基因型植株在同样的试验条件下，小孢子培养的诱导频率差异很大[6]。方淑桂等[7]在相同条件下利用80份供试材料的小孢子进行培养，只有20个产生胚状体。赵前程等[8]对参试的186个试材进行小孢子培养，仅有55个材料得到了小孢子胚，出胚率为29.7%。张晓芬等[2]在对12个供试品种的试验中也发现了基因型对胚胎诱导的关键作用。

3.2 供体植株小孢子胚发育阶段

能否诱导小孢子发育成胚与小孢子发育阶段息息相关。Sato等[9]研究指出，单核靠边期和双核早期是适宜小孢子培养的最佳时期。在与花椰菜同属十字花科的大白菜游离小孢子培养中，单核后期是诱导小孢子胚胎发育的最佳时期[9]。方淑桂等[7]和星晓蓉[10]的研究结果都表明，在花椰菜小孢子培养中，只有单核晚期至双核期的小孢子才能发育成胚状体。此时花蕾长度为4.6～5.5 mm，此间产胚率最高，平均每蕾可产蕾约30个。而处于单核早期和三核期的小孢子一般不会膨大[7，11]。

3.3 花椰菜供体植株和花粉的生理状态

受栽培环境、花期及其花蕾生理状况的影响，诱导小孢子成胚率不同。在对十字花科作物的研究中，张凤兰等[12]利用人工气候室研究了不同光照和温度对小孢子胚胎发生的影响，结果表明： 日照时数为14 h、温度在15～20 ℃最有利于小孢子胚的发生，此时产胚率最高。高温短日照对小孢子最为不利。李浩杰等[13]在对甘蓝类油菜小孢子培养研究中发现，昼夜温差5 ℃左右时胚产量最高，温度低于5 ℃或高于20 ℃胚产量都较低甚至不出胚。顾宏辉等[14]在对早熟花椰菜小孢子的研究中也发现，早熟花椰菜中，适宜小孢子胚胎发育的最佳时期较少，这与其生长环境可能存在一定关系。

3.4 高温处理

高温热激预处理是促进细胞对称分裂、改变小孢子发育方向的主要条件[15-17]。许多研究表明，甘蓝类小孢子培养初期不经过高温处理，培养无反应，而经过高温处理的，因温度和处理时间不同，胚产量高低也有差异。方淑桂等[7，11]对花椰菜游离小孢子的研究表明，33 ℃下处理48 h效果最好，产胚量明显高于其他处理。赵前程等[8]对花椰菜小孢子高温处理研究表明，32 ℃下，处理24 h效果最佳。

3.5 培养液对胚状体发生的影响

NLN培养基是花椰菜游离小孢子培养的常用培养基。方淑桂等[7]在游离花椰菜小孢子培养过程中发现，培养基中19%蔗糖浓度下，小孢子存活率最高，而在13%蔗糖浓度下，诱导成胚率最高，因此，添加和更换培养液对胚状体的影响非常重要。赵前程等[8]研究表明，在培养基中添加6-BA 0.1 mg·L-1和NAA 0.005 mg·L-1的激素组合，能促进小孢子胚状体的发育，形成球型胚的发生频率最高。

3.6 不同日龄对胚状体的影响

花椰菜小孢子胚状体发育比较缓慢，离体培养20 d后，发育成球型胚，此时应将胚状体转移到脱分化培养基上，诱导出愈伤组织后再进行诱导分化，就能够获得高效率的植株再生。赵前程等[8]试验表明，不同日龄的胚状体进行脱分化处理的成活率不同，20 d的胚状体成活率最高。

4 培养技术

4.1 分离小孢子的方法

目前分离小孢子的方法有两种：（1）自然散落法。即将处于小孢子成胚发育最佳时期的花蕾清洗消毒后，在无菌的条件下，取出花药，接种在培养基上，任其花粉散落。（2）机械挤压法。将用酒精和次氯酸钠消毒后的花蕾置于研钵中，用研磨棒将花粉挤压出来，用尼龙网过滤，再用B5培养基冲洗，经过多次离心，得到游离小孢子[18-19]。

4.2 培养基及其附加物

在花椰菜小孢子培养中，一般采用蔗糖浓度为13%的NLN培养基，赵前程等[8]研究表明，在培养基中添加6-BA 0.1 mg·L-1和NAA 0.005 mg·L-1的激素组合，能促进小孢子胚状体的发育，形成球型胚的发生频率最高。小孢子在发育过程中，会释放有毒物质，这些有害物质会降低小孢子胚状体的成活率。杨清等[19]报道，在冬花椰菜的小孢子培养过程中，加入0.5 g·L-1的活性炭能提高胚的发生率。Dais和Martins[20]在花椰菜小孢子培养过程中，加入AgNO3 能够促进胚胎的形成。

4.3 高温预处理

将培养基放置在高于正常温度的条件下，进行热激处理。一般认为33 ℃下预处理24 h，转入24 ℃下培养，出胚率较高。此外，花粉密度对小孢子的培养也非常重要。Duijs[21]研究表明，小孢子密度为2×104～4×104个·mL-1最适合。

4.4 植株的再生

小孢子培养3 d左右将发生第一次分裂，2～3周后依次出现球型胚和心形胚，继续培养，将出现子叶胚，转移到分化培养基上发育成植株。经小孢子培养得到的是单倍体植株，经化学试剂如秋水仙素处理，或者田间自然加倍，可得到纯合二倍体。而赵前程等[8]研究结果表明，在花椰菜小孢子的培养过程中，存在较高频率的自然加倍，认为经花椰菜小孢子培养得到的再生植株，不需要进行人工加倍，其具有自然加倍成二倍体的特点，这一发现，使利用小孢子培养得到纯和亲本的育种工作变得更加快捷。

5 前景与展望

经过多年的研究探索，我国花椰菜游离小孢子培养技术逐渐完善，应用于育种工作取得重大突破与成功。但利用小孢子发育成胚状体诱导率不高，添加适当的激素可以提高易出胚的产胚率，但是尚未找到促使难出胚材料出胚的激素配比[22]。关于小孢子培养的启动机制、微观发育机制、发育途径以及与之相关的生理生化方面的理论研究仅在猜测和探究过程中[23]，基因型影响出胚率是毋庸置疑的，但如何克服这一困难，在分子与蛋白质水平上还有待研究，应该加强小孢子培养技术与细胞工程、基因工程等其他生物技术的结合[18]。不断完善小孢子培养技术，同时探究其理论基础，使这项技术能更好地为我们所利用。

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