牛奶中黄曲霉毒素M1常见检测方法比较

万珊 朱曦 梁利妹 董文婷

摘要：黄曲霉毒素M1（ AFM1）是动物摄入黄曲霉毒素B1（AFB1）后在体内经羟基化形成的代谢产物，具有极强的毒性，存在于乳中。介绍了黄曲霉毒素M1（ AFM1） 的危害以及牛奶中黄曲霉毒素M1的薄层色谱（TLC）检测法、高效液相色谱（HPLC）检测法和快速检测法，并比较了各种方法的优缺点和适用范围。

关键词：黄曲霉毒素 M1；危害；检测方法；比较

中图分类号：TS252.7 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）06-0078-03

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）主要是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的代谢产物，之所以广受重视是因为它是人类癌症的一个重要的致癌源。至今已分离出的黄曲霉毒素及其衍生物有20多种，在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见。在AF中，已知毒性大小顺序为AFB1>AFM1>AFG1>AFB2>AFG。

黄曲霉毒素 M1（Aflatoxin M1，AFM1）是动物摄入黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）后在体内经羟基化形成的代谢产物，毒性仅次于AFB1，WHO将其列为ⅡB类致癌物。AFM1主要存在于动物的乳、肾脏、肝脏、蛋、肉和尿中，其中以乳中最为常见。

把发霉的谷物作为饲料，其中的黄曲霉毒素在24 h之后就能进入奶中。王蕾指出黄曲霉毒素被动物食用后，一部分会蓄积在动物的体内，另外一部分则会转化到乳汁和尿液中，转化率一般为3.45%～11.39%[1]，排出AFM1的量为AFB1摄入量的1%～3%[2]。

1 黄曲霉毒素M1的基本性质及危害

黄曲霉毒素基本结构由一个二呋喃环和一个氧杂萘邻酮组成，前者为其毒性结构，后者可能与其致癌作用有关。黄曲霉毒素M1一旦产生便很难消除，因为它对光、热和酸都比较稳定，熔点（裂解温度）在299 ℃。牛奶常见的3种消毒方法都对它无可奈何。

黄曲霉毒素M1进入人或动物体内后，除抑制DNA、RNA合成外， 也抑制肝脏蛋白质合成，导致人体中毒。其危害主要表现在3个方面：损害组织器官；致癌、致畸、致突变，引发动物及人类的肝癌、肾癌和胃癌等[3-5]；抑制免疫机能。其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，主要危害的部位在肝脏。

2 牛奶中AFM1的限量

牛奶中AFM1限量取决于科学、社会和经济方面的诸多因素，这些因素相互影响、制约，综合地决定牛奶中AFM1限量值。目前，世界各国对食品中AFM1的含量都制定出了严格的限量标准。牛奶中AFM1限量值采用0.05 μg/kg的国家最多，为34个，其中绝大部分国家是欧盟成员国以及与欧盟有贸易的非洲、亚洲、拉丁美洲部分国家，欧盟对婴幼儿配方食品，包括婴幼儿配方牛奶限量0.025 μg/kg。另一个限量值为0.5 μg/kg，有22个国家，包括美国、中国以及若干亚洲和欧洲国家。还有4个国家分别采用15、5、0.2 μg/kg以及不得检出[6]。一些主要国家牛奶中AFM1的限量标准见表1。

3 牛奶中AFM1的检测方法

3.1 薄层层析法（TLC法）

TLC法是测定牛奶中黄曲霉毒素的经典方法，是通过肉眼比较定性或者半定量的检测方法。其原理是将样品经提取、浓缩、薄层分离后，AFM1在紫外光（波长365 nm）下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量与标准溶液的荧光强度相比较来测定含量。GB 5009.24～2010食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定、ISO 14674：2005（IDF 190：2005）牛奶和奶粉黄曲霉毒素M1的测定、AOAC 974.17乳制品中黄曲霉毒素M1的测定和AOAC 980.21牛奶和奶酪黄曲霉毒素M1的测定就是采用的TLC法[7-10]。

TLC法的优点在于不依赖特殊仪器，成本低，易于普及，双向展开避免了杂质干扰，被用于大规模的筛查研究中。虽然TLC法是牛奶中黄曲霉毒素M1 测定的官方规定方法之一，但是随着高效液相色谱和液相色谱-质谱连用技术的发展，TLC的缺点也逐渐显现：对样品处理繁琐，过程复杂，且提取和净化效果不够理想，双向展开增加了操作步骤和时间，对人和环境污染系数较大。

3.2 高效液相色谱法（HPLC法）

HPLC法是利用免疫亲和柱或C18柱将样品中的AFM1萃取、净化、浓缩、分离，再通过HPLC串联不同检测器进行检测。免疫亲和柱是利用抗原抗体的特异性吸附特性， 亲和柱只能特异性、选择性地吸附AF，而其他杂质则顺利通过柱子， 然后再利用洗脱液将AF洗脱下来。该方法大大简化了样品的前处理过程， 同时利用高效液相色谱进行定量和定性， 可以同时测出AF的总量和AFM1、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2各自含量。我国GB/T 23212～2008牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2的测定和GB 5413.37～2010乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定（第一法免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法、第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法）均是采用免疫亲和柱萃取分离AFM1[11，12]。荧光（Fluorescence detection， FLD）、质 谱（Mass spectrometry， MS）等的定量测定被广泛用于牛奶中AFM1的检测。

3.2.1 HPLC-FLD 配以荧光检测器的反相HPLC法已经成为检测黄曲霉毒素的主要测定方法，这是因为反相HPLC方法具有同时分离多种黄曲霉毒素的功能和快速、高效、灵敏、定量准确的优点，而且不受样品的沸点、热稳定性和分子量等的限制；荧光检测器具有灵敏度高、选择性强、分离能力强、干扰峰少的优点，而牛奶中AFM1具有较强的发射荧光特性。

3.2.2 HPLC-MS 质谱法是通过将试样分子裂解为分子离子和各种离子碎片的集合，按质荷比（m/z）大小进行分离、记录的分析方法。MS检测器具有更高的选择性、对分析物分子标识的确证、可用同位素标记作为内标等优势，HPLC-MS比传统液相检测器灵敏度更高，选择性更强，提供了可靠、精确的相对分子质量及结构信息，简化了试验步骤，节省了样品准备时间和分析时间，广泛应用于AFM1的检测中。ISO 14501：2007（IDF 171：2007）牛奶和奶粉黄曲霉毒素M1含量的测定和我国GB 5413.37-2010乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定（第一法免疫亲和层析净化 液相色谱-串联质谱法）采用的就是LC-MS法检测奶中的黄曲霉毒素M1[12]。

3.3 免疫层析净化荧光分光度法

免疫层析净化荧光分光度法的原理是将试样经过离心、脱脂、过滤后，滤液经过含有黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体的免疫亲和柱层析净化，除去其他杂质， 再洗脱下黄曲霉毒素M1，用荧光光度计测定黄曲霉毒素M1的含量。其中测定时是先用荧光光度计标定溶液进行荧光光度计校准，再进行AFM1的含量的测定。优点在于分析过程中不使用AFM1的标准物质，避免了操作人员造成的污染危险，不用担心AFM1标准品的购买困难，具有准确、快速、安全、简单等特点，可以满足少量和批量样品的检测需要[13]。我国GB 5413.37-2010乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定（第三法免疫层析净化荧光分光度法）采用的就是此种方法检测奶中的黄曲霉毒素M1[12]。

3.4 快速检测法

3.4.1酶联免疫吸附法（ELISA） 酶联免疫分析技术在黄曲霉毒素分析过程中是最为引人注目的，因为它们具有高度的灵敏度和选择性，而且具有快速和大批量检测的能力。ELISA的原理是样品中的黄曲霉毒素与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，在固相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分，加入酶标Ⅱ抗，与抗体反应通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中黄曲霉毒素的含量。

ELISA具有快速、灵敏、特异性强、成本低等特点，大大减轻了工作人员的劳动量，样品不需特殊处理，直接测定，仪器操作简单，适合于AFM1大批样品的检测筛选，可用于现场检测。我国DB33/T 556-2005乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定使用酶联免疫吸附法，ISO 14675：2003（IDF186：2003）牛奶和牛奶制品，竞争酶联免疫分析的标准化描述指南.黄曲霉毒素M1含量的测定即为ELISA法[14，15]。竞争性酶联免疫吸附试验从1995年起已成为AOAC检测黄曲霉毒素的官方方法。

3.4.2 胶体金法 胶体金法基于竞争法胶体金免疫层析技术，用于快速筛查含有AFM1 的液态奶、奶粉（含婴儿奶粉）和饲料等样品。此法将检测样品液加入速测卡上的样品孔，检测液中的AFM1与金标卡上的金标抗体结合形成复合物，若AFM1在检测液中浓度低于设定检测灵敏度值（阴性样本），未结合的金标抗体流到T区时，被固定在膜上的抗原捕获，形成一条可见的T线；若AFM1 浓度高于设定检测灵敏度值，金标抗体即与AFM1全部形成复合物，不再与T线处抗原结合，T线不可见。C线为质控线，出现则说明该速测卡有效。邓省亮等[16]、孙秀兰等[17]等分别制备和研究了胶体金检测卡以及样品基质对试纸条信号灵敏度的影响，并为消除这些影响提供了经验。市面上的速测卡盒在2～8 ℃可稳定保存4个月，检测一个样品费用仅需几十元。此方法快速便捷，操作简单，成本低，适用于大量筛查牛奶中AFM1，节省了人力、物力、财力。

3.4.3 SNAP法 利用酶联免疫竞争原理，样品中残留的黄曲霉毒素M1与定量特异性酶标抗体反应，多余的游离酶标抗体则与酶标板内的包被抗原结合，通过流动洗涤，加入酶显色底物显色后，与标准点比较定性。GB 5413.37～2010 乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定（第四法）和NY 1664～2008 牛乳中黄曲霉毒素M1的测定均采用此法[12，18]。

4 小结

目前， 人们逐渐认识到牛乳具有提高机体免疫力、增强体质等优点， 已成为不可缺少的常用食品，牛奶的安全性也日益受到重视，所以对于牛奶中AFM1的污染控制是牛奶生产中的重中之重。

薄层层析法是经典方法，一般实验室均能完成，虽不断改进，但在抗干扰、精密度方面仍有缺陷，且步骤繁琐，对人员危害大。亲和柱HPLC-FLD灵敏度、精密度等均可满足AF检测要求。HPLC-MS具有预处理简单、检测速度快、灵敏度高的优点，可以满足少量和批量样品的检测需要，但对于仪器要求较高，成本也较高。免疫层析净化荧光分光度法测定过程中不使用AFM1的标准物质，避免污染危险，具有准确、快速、安全、简单等特点。根据其特点这几种方法适合实验室检测。ELISA、胶体金法和SNAP法适合于现场筛查。ELISA使用安全，操作简便、快捷，适合大批量样品筛查，但适用酶、抗体对保存条件、时间又有一定要求。胶体金法和SNAP法更加方便快捷，但主要用于定性。此外，乳及乳制品特别是生乳的贮存条件特殊，不宜长时间运输贮存，快速检测对大规模监测具有重要意义。同时，快速的现场检测可以提高检测效率，加大监测范围和力度，保证牛奶质量安全。采用快速检测技术（最好是胶体金速测卡）初步筛查后，再用HPLC-FLD法、HPLC-MS法等定量法对快速法筛选出的阳性或超标样品进一步确证，这可能是解决大批量牛奶检测的最好方法。

参考文献：

[1] 王 蕾.牛奶中黄曲霉毒素M1检测方法的建立及饲料中黄曲霉毒素对牛奶品质的影响[D].河南农业大学，2008.

[2] VELASCO R M L， DELSO M M C， ESCUDERO D O. ELISA and HPLC determination of the occurrence of alfatoxin M1 in raw cow's milk[J].Food Addit Contam，2003（20）：276-280.

[3] 陈爱民，徐耀初.AFT致肝癌的分子机制及其化学预防[M] .国外医学：卫生学分册，1998，25（5）：285-288.

[4] 卿中全，于炎湖.AFT对家禽生产性能和健康的影响[J] .中国饲料，2000（3）：35-37.

[5] MISHRA H N， CHITRANGADA D. A review on biological control and metabolism of aflatoxin[J]. Critical Reviews in Food Science and Nuteition，2003，43（3）：245-264.

[6] 黄良策，程建波，郑 楠，等.牛奶中黄曲霉毒素M1检测方法研究进展[J]. 食品安全导刊，2012（3）：39-41

[7] GB 5009.24-2010，食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定[S].

[8] ISO 14674：2005（IDF 190：2005），牛奶和奶粉黄曲霉毒素M1的测定[S].

[9] AOAC 974.17，乳制品中黄曲霉毒素M1的测定[S].

[10] AOAC 980.21，牛奶和奶酪黄曲霉毒素M1的测定[S].

[11] GB/T 23212-2008，牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2的测定[S].

[12] GB 5413.37-2010，乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定[S].

[13] 张 鹏，张艺兵，王 晶，等.牛奶及奶粉中黄曲霉毒素M1的快速测定[J].中国乳品工业，2002，30（6）：30-32.

[14] DB33/T 556-2005，乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定使用酶联免疫吸附法[S].

[15] ISO 14675：2003（IDF186：2003），牛奶和牛奶制品.竞争酶联免疫分析的标准化描述指南.黄曲霉毒素M1含量的测定[S].

[16] 邓省亮，赖卫华，许畅.胶体金免疫层析法快速检测AFTB1的研究[J].食品科学，2007，28（2）：232-235.

[17] 孙秀兰，张银志，汤 坚，等.金标免疫层析试条检测样品中AFTB1的误差分析[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2007，35（7）：188-192.

[18] NY 1664-2008，牛乳中黄曲霉毒素M1的测定[S].