辛伐他汀对人牙髓干细胞成骨活性的影响

运慧媛　袁梦桐　刘明月　王钰莹　缪宏颖

[摘要]目的：研究辛伐他汀对人牙髓干细胞成骨活性的影响。方法：将体外分离培养的人牙髓干细胞分别接种于含有不同浓度辛伐他汀的矿化培养液中诱导培养，测定碱性磷酸酶活性及骨唾液酸蛋白基因的表达情况。结果：与对照组比较，适宜浓度辛伐他汀（1×10^-6mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-8mol/L）促进人牙髓干细胞的成骨活性作用更为明显，差异具有统计学意义（P<0.05），当辛伐他汀浓度为1×10^-7mol/L时，促进作用最显著。结论：适宜浓度的辛伐他汀可以有效促进人牙髓干细胞的成骨活性。

[关键词]牙髓干细胞；辛伐他汀；成骨活性

[中图分类号]Q813.1 R782.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）06-0644-04

辛伐他汀为一种无活性的内酯类结构药物，口服后在肝脏中吸收，主要水解为相应的β-羟酸，此结构是催化胆固醇合成的早期限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A reductase，HMG-CoA）还原酶的抑制剂。辛伐他汀临床常用于控制血液中胆固醇的含量以及预防心血管疾病的发生。与相同剂量的洛伐他汀（lovastatin）、普伐他汀（pravastatin）和氟伐他汀（fluvastatin）等其他HMG-CoA还原酶抑制剂相比，辛伐他汀可以更有效地降低血清中的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-cholesterol）的含量，临床疗效更为显著。实验研究发现，辛伐他汀亦具有促细胞成骨分化的功能，为辛伐他汀的临床应用开辟了新的领域。Mundy等通过荧光素酶标记基因转染等多种实验途径，首次验证了辛伐他汀的体内及体外促成骨活性。2009年，Okayama等实验证明辛伐他汀能激活BMP-2的启动子，诱导BMP-2 mRNA和蛋白的表达，提示其具有刺激骨形成的作用。人牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）可向成骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、肌细胞等多种细胞分化，拥有多向分化的潜能，它可以作为一种组织工程的种子细胞。组织工程修复牙体及颌骨缺损一直以来是口腔修复的目标，人牙髓干细胞作为一种组织来源更为接近的种子细胞，口腔科组织工程应用更具优势。本实验旨在证明人牙髓干细胞作为种子细胞的可行性，为牙体及颌骨缺损的组织工程修复提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料：胎牛血清（Hyclone，美国）；DMEM F/12（Gibco，美国）培养基；I型胶原酶（Gibco，美国）；胰酶（碧云天生物技术研究所，上海）；青链霉素（碧云天生物技术研究所，上海）；PBS缓冲溶液；抗坏血酸（sigma，美国）；β-甘油磷酸钠（sigma，美国）；L-谷氨酰胺（sigma，美国）；茜素红（sigma，美国）；碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京）；辛伐他汀（sigma，美国）；Triton X-100（碧云天生物技术研究所，上海）。TRNzol总RNA提取试剂（天根生化科技有限公司，北京）；逆转录试剂盒（Bioneer，韩国）；PCR试剂盒（创奇，北京）

1.2 方法

1.2.1 DPSCs分离培养及传代：选择哈尔滨医科大学附属第二医院口腔外科门诊采集的因正畸拔除的正常前磨牙或阻生的正常第三磨牙（患者14～25岁），所有成年患者及未成年患者家属均知情同意。依据Gronthos DPSCs原代细胞培养法，劈开实验牙，用镊子取出牙髓，含双抗PBS充分冲洗，置于体积分数为0.3%的I型胶原酶和0.4%的分散酶（1：1）37℃横湿振荡器内消化1h，200目尼龙筛过滤悬液至10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入含20%FBS培养基，吹打混匀，血球计数板计数以1×10⁸个/L细胞接种至50ml培养瓶，37℃，5%CO₂恒温培养箱中培养。每周换液两次，细胞融合达80%后，0.25%胰蛋白酶消化，1：2比例传代。

1.2.2 DPSCs鉴定

1.2.2.1 细胞形态学鉴定：倒置相差显微镜观察细胞的生长情况和形态特征。

1.2.2.2 矿化结节鉴定：将第三代人DPSCs以1×10⁵个/孔接种于六孔板中，12h后，各孔换为矿化培养液（DMEM F/12培养基、胎牛血清、青链霉素、100μmol/L抗坏血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，2mmol/L L-谷氨酰）继续培养14天后进行茜素红染色，培养皿PBS缓冲液冲洗3遍，95%无水乙醇固定15min，蒸馏水冲洗3次，0.1%茜素红-Tris—HCI（pH=8.3）37℃孵育30min，蒸馏水轻轻冲洗，干燥，照相。

1.2.3 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性测定：将第三代人DPSCs以5×10³个/孔接种在九十六孔板中，12h后，各孔换为矿化培养液继续培养，细胞培养分A、B、C、D四组，各组辛伐他汀浓度为A组：1×10^-6mol/L；B组：1×10^-7mol/L：C组：1×10^-8mol/L；D组：0 mol/L。每组各10孔，继续培养3天，去除培养板中培养液，0.01mol/L PBS冲洗细胞3次，加入50μl 0.1%Triton X-100，4℃冰箱过夜，光镜下观察已无明显细胞结构，反复吹打后每个样本加入ALP缓冲液和基质液各50μl，充分混匀，37℃水浴15min，加入显色剂150μl，在酶标仪上选择520nm波长检测各孔吸光度（A）值，观察各组细胞ALP活性。

1.2.4 反转录聚合酶链反应（Reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）检测骨唾液酸蛋白基因表达：将第三代人DPSCs以1×105个/孔接种于六孔板中，12h后，各孔换为矿化培养液，细胞培养分A、B、C、D四组，各组辛伐他汀浓度为A组：1×10^-6mol/L；B组：1×10^-7mol/L：C组：1×10^-8mol/L；D组：0mol/L。每组样本量为3，继续培养7天后进行RT-PCR实验。依据操作手册使用Trizol试剂裂解细胞，提取总mRNA。参照RT-PCR逆转录试剂盒操作说明书将总mRNA依次按70℃5min、50℃ 1h、95℃5min逆转录为cDNA。PCR反应条件为：94℃2min预变性后，94℃ 30s、48.2℃30s、72℃ 30s，35个循环，72℃ 2min延伸，4℃保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统分析。以电泳条带的强度×面积求得基因表达量，将基因表达量除以管家基因表达量求得基因阳性表达水平。RT-PCR引物序列（见表1）。

1.2.5 统计学分析：使用SPSS 15.0统计学软件，计量资料采用“均值±标准差”形式描述。

对实验组与对照组检测结果进行t检验和方差分析。

2 实验结果

2.1 DPSCs光学显微镜下细胞形态学变化：DPSCs原代培养24h内细胞贴壁缓慢，可见细胞为梭形，形态较小，未完全伸展，且有少量悬浮未贴壁细胞。48h，细胞梭形，贴壁较多，少量细胞呈克隆团状生长（见图1）。7天后可见DPSCs大量扩增，呈伸展长梭形，克隆团状聚集生长，细胞融合率可达80%（见图2）。

2.2 矿化结节鉴定：DPSCs 14天培养后，可见部分细胞发生成骨细胞样多角形以及锥体形态改变。DPSCs在矿化诱导后逐渐产生白色点状晶体。经茜素红染色后光学显微镜下可见橘红色矿化结节，呈团状不规则形态（见图3）。

2.3 辛伐他汀对DPSCs碱性磷酸酶活性的影响：在矿化诱导条件下，辛伐他汀对人牙髓干细胞ALP活性有促进作用，1×10^-6mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-8mol/L组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中1×10^-7mol/L组对ALP活性的影响最显著（见表2）。

2.4 辛伐他汀对DPSCs BSP表达的影响：与对照组比较，各组BSP表达均较高。其中，辛伐他汀浓度为1×10^-7mol/L时，BSP表达量最高（见表3）。

3 讨论

多项体内及体外的实验研究发现，辛伐他汀具有明显的促进骨形成的作用。2001年，Meada等发表文章，研究辛伐他汀作用下，非转化成骨样细胞MC3T3-E1和鼠骨髓细胞的生长情况，发现辛伐他汀提高成骨细胞碱性磷酸酶活性并促进矿化结节形成，此效应呈时间、剂量依赖性。胡飞等研究辛伐他汀对人牙周膜细胞成骨活性的影响，证明适宜浓度辛伐他汀提高了人牙周膜细胞ALP活性和骨桥蛋白的表达，有效促进了人牙周膜细胞的成骨活性。Chan等统计分析表明，服用他汀类药物可增加股骨颈骨密度，长期服用降低老年妇女发生非病理性骨折的危险性。张晓艳等利用含有β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C的条件培养液，成功诱导人前磨牙牙髓干细胞向成骨细胞样细胞的分化，充分说明人牙髓干细胞的骨向分化潜能，为人牙髓干细胞的临床应用提供了理论依据。

ALP是一种分泌型蛋白，它的表达是成骨细胞分化的主要特征之一，是基质成熟的早期标志物。其主要作用是水解胞浆中的有机磷酸释放出无机磷，促使基质矿化。测定细胞内ALP活性变化作为一种常用的手段用于细胞成骨分化程度和细胞矿化能力的检测。当成骨细胞进入矿化期，细胞内碱性磷酸酶活性下降，而此时与细胞外基质中羟基磷灰石沉积相关的基因表达达到高峰，如骨桥蛋白、骨钙素、骨唾液酸蛋白基因。骨唾液酸蛋白由成骨细胞、破骨细胞以及其他一些骨相关细胞合成和分泌，其表达局限于矿化组织中。

本实验通过ALP试剂盒、RT—PCR法观察辛伐他汀作用后，人DPSCs矿化能力的改变。结果表明辛伐他汀浓度在1×10^-8mol/L～1×10^-6mol/L范围内，与对照组比较，ALP活性及BSP基因的表达量均提高，当辛伐他汀浓度为1×10^-7mol/L时，促进作用最明显，证实辛伐他汀诱导人DPSCs是一种可行、有效的促进成骨活性的方法，与以往的实验结论相同。但辛伐他汀的有效作用浓度各实验研究结果不尽相同，可能与细胞种类、培养方法及培养环境相关，还有待进一步的研究。