CRF受体对五羟色胺系统的调节作用及早期环境因素的影响

原三娜　王琼　邵枫　王玮文

摘要：早期环境因素持续影响脑与行为的发展，增加个体成年后应激相关精神疾病患病的易感性。应激反应的中枢启动因子促肾上腺皮质激素释放因子（corticotropin-releasing factor，CRF）通过两种受体CRFI和CRF2调节中缝背核（dorsal raphe nucleus，DRN），五羟色胺（serotonin，5-HT）系统，后者已被证实在应激相关情绪疾患发病和治疗过程中发挥重要作用。已知CRF受体以相互影响相互拮抗的方式动态调节DRN-5一HT系统，提示这两种受体相对作用的调节对于协调复杂环境中DRN-5-HT系统的应激反应过程起着关键性作用。早期环境因素和遗传因素交互作用导致CRF受体的分布和反应性持续改变并造成DRN-5-HT系统反应异常，可能是导致应激反应和精神疾病易感性个体差异的重要神经基础。

关键词：促肾上腺皮质激素释放激素；早期环境因素；中缝背核；五羟色胺

分类号：B845

临床和基础研究证据显示早期环境因素能够持续影响中枢应激环路活动，增加个体成年后应激相关精神疾病患病的风险（Gilmer&McKinney，2003；McEwen，2006）。脑干中缝背核（dorsal raphenucleus，DRN），五羟色胺（serotonin，5-HT）系统活动异常已被证实在应激相关情绪疾患，尤其是抑郁症和焦虑症发病和治疗过程中发挥重要作用（Manji，Drevets，&Charney，2001；Pariante&Lightman，2008；Ressler&Nemeroff，2000）。促肾上腺皮质激素释放因子（corticotropin-releasing factor，CRF）作为应激反应的中枢驱动因子，参与行为，神经内分泌，神经生化等应激反应不同方面的调节（Bale&Vale，2004）。CRF通过两种受体CRFl和CRF2相互作用调节DRN-5-HT系统的应激反应过程（Valentino，Lueki，&Vall Bockstaele，2010）。越来越多的研究证据显示，早期环境因素和遗传因素交互作用导致CRF受体系统分布和反应模式持续改变并造成DRN-5-HT系统反应异常，可能是介导应激相关精神疾病易感性个体差异的生物学基础之一。

1.CRF调节DRN-5-HT系统的结构基础和一般生理

CRF是一种由41个氨基酸组成的小分子肽类。作为应激反应的中枢驱动因子，CRF通过两种受体CRFl和CRF2发挥生物学效应（Bale&Vale，2004）。在啮齿类动物脑内CRF1分布最为广泛，约70%的CRF受体基因编码为CRF1，其余为CRF2（Hauger，Risbrough，Brauns，&Dautzenberg，2006）。脑内5-HT能神经元主要分布在DRN，后者也是边缘脑区5-HT能神经投射的主要来源（Hensler，2006；Mann，1999）。DRN同时存在CRF1和CRF2 mRNA。与其他脑区CRF1优势表达不同，DRN是唯一表达相对高水平CRF2的脑区（chalmers，Lovenberg，&De Souza，1995）。除了5-HT能神经元，DRN还存在其他类型神经元，如GABA，SP等。它们与DRN 5-HT能神经元间存在突触联系（Waselus，Valentino，&van Bockstaele，2005）。CRF1和CRF2受体在DRN 5-HT能和非5-HT能神经细胞都有表达（Day et al.，2004；Lukkes et al.，2011；Waselus et al.，2005），提供了CRF受体通过直接或者间接途径调节DRN-5-HT系统的结构基础。

CRF受体在神经细胞的分布模式和反应性随着环境改变而动态变化。在非应激（生理）条件下，细胞膜上主要表达CRF1（约50%的CRF1分布在细胞膜上），而CRF2主要存在于细胞质中（85%的CRF2分布在细胞质中）。在应激条件下，这两种受体的分布模式发生反向变化。通过内化和脱敏机制CRF1在细胞膜的表达和反应性降低，而CRF2则向外迁移增加在细胞膜的表达（Waselus，Nazzaro，Valentino，&van Bockstaele，2009）。此外，CRF1和CRF2对CRF刺激的敏感性存在明显差异。CRF对CRF1的亲和力约为CRF2的10倍（Bale&Vale，2004）。因此生理或适度应激条件下低浓度CRF主要激活CRF1，而强烈应激条件下高浓度CRF同时激活这两种受体。总的来说，随着环境改变CRF受体通过再分布机制动态调节5-HT系统的适应性变化过程。

2.CRF对DRN-5-HT系统的调节作用

DRN-5-HT系统包括5-HT能神经核团和向目标脑区的5-HT能神经投射两部分。应激研究发现侧脑室或者DRN微注射CRF均以类似的剂量依赖的方式调节DRN-5-HT系统活动，提示CRF对脑内5-HT系统的调节作用主要通过DRN介导。其中低剂量CRF降低DRN 5-HT能神经元活动和目标脑区5-HT释放，选择性CRF1拮抗剂阻断上述效应；随着剂量增加，上述效应减弱并逐渐转变为相反的兴奋性作用，即高剂量CRF增加DRN5-HT能神经元活动和5-HT释放，选择性CRF2拮抗剂阻断上述效应（Thomas，Pemar，Lucki，&Valentino，2003；Valentino et al.，2010）。进一步的研究显示CRF1和CRF2在DRN-5-HT系统调节中发挥相反的作用。选择性CRFl激动剂抑制DRN5-HT能神经元活动和目标脑区5-HT释放：而选择性CRF2激动剂（urocortin II，UII）则增加DRN5-HT能神经元活动（c-fos表达增加）和目标脑区5-HT释放（Amat et al.，2004；Kirby et al.，2008；Kirby，Rice，&Valentino，2000；Lukkes，Forster，Renner，&Summers，2008；Staub，Evans，&Lowry，2006）。

5-HT系统的双阶段应激反应模式可能与CRF1和CRF2在神经细胞的分布和反应性差异有关。如前所述，CRF1主要表达在细胞膜上而CRF2主要分布在细胞质内，且CRF1对CRF刺激的反应敏感性明显高于CRF2（Bale&Vale，2004），因而低剂量CRY主要通过CRF1抑制DRN-5-HT系统活动；随着CRF剂量增加，诱导CRF1内化和CRF2向外迁移导致这两种受体在胞膜的分布模式反转（Waselus et al.，2009），，因而高剂量CRF主要通过CRF2增强DRN-5-HT系统活动。相关研究也发现急性和慢性游泳应激条件下DRN-5-HT系统活动产生类似的动态变化过程。例如急性游泳应激抑制DRN5-HT能神经细胞活动，CRF1拮抗剂阻断上述作用（Kirby，Allen，&Lucki，1995；Price，Kirby，Valentino，&Lucki，2002）。急性应激诱导的上述改变在重复给与游泳应激时逐渐消退，同时伴随CRF1和CRF2的分布模式改变，即胞膜CRF1表达逐渐减少而CRF2的表达逐渐增加，且这一变化与受体介导的神经细胞电生理活动从抑制向兴奋改变的过程一致（Waselus et al.，2009）。上述研究证据表明CRF受体之间相互影响相互拮抗动态调节DRN-5-HT系统应激反应过程。

神经解剖学研究进一步显示CRF受体可以通过多种作用途径发挥上述影响。CRF1和CRF2在DRN 5-HT能和GABA能神经元（一种主要的抑制性神经元）均有分布，且GABA能神经元与5-HT能神经元存在突触联系（Waselus et al.，2005），提示CRF受体可以直接调节5-HT能神经元，也可以通过影响GABA能通路间接调节。例如低剂量CRY和某些应激（如急性游泳应激）抑制DRN5-HT能神经元活动和投射脑区如外侧隔区5-HT释放的作用由CRF1通过激活GABA能神经元介导。CRF1拮抗剂阻断上述改变（Roche，Commons，Peoples，&Valentino，2003；Thomas et al.，2003）。与此一致，采用膜片钳技术也发现CRF1激活GABA能神经元并增加其投射终端5-HT能神经细胞上的GABA释放（Kirby et al.，2008）。与此相反DRN给与CRF2激动剂剂量依赖地抑制GABA能神经元活动伴随5-HT能神经元活动增强（Amat et al.，2004；Staub et al.，2006），提示CRF2通过GABA介导的脱抑制作用增强5-HT能神经元活动。综上，CRF1和CRF2可以分别通过抑制和增强GABA能神经元活动间接产生对DRN-5-HT能神经元相反的调节作用。

值得注意的是CRF受体在DRN 5-HT能和GABA能神经元的分布存地形差异。从嘴端向尾端方向DRN中间部位的CRF受体主要在5-HT能神经元表达，而在DRN尾端CRF受体在GABA能和5-HT能神经元上均有表达且以前者为主（Day et al.，2004；Lukkes et al.，2011；Staub et al.，2006；Waselus et al.，2005）。考虑到不同前脑目标脑区的5-HT能神经投射由DRN不同亚区的5-HT能核团发出。例如从嘴端向尾端方向自DRN腹侧中部到最尾端神经核团发出的5-HT能神经纤维依次投射到内侧前额叶（medial prefrontal cortex，mPFC），基底外侧杏仁核（amygdale，AMG）和海马（hippoeampus，HIP），而自DRN背侧尾端和嘴端发出的5-HT能神经纤维分别投射到外侧隔区（lateral septum，LS）和纹状体（striatum，ST）（Homberg&Contet，2009；Waselus，Galvez，Valentino，&vanBockstaele，2006）。上述分布的地形差异提示CRF受体可能直接调节DRN中间部位5-HT能神经核团，但对向DRN尾端迁移的5-HT能神经核团的调节作用也可能通过GABA能神经通路介导，从而造成不同应激情况下对目标脑区5-HT释放的复杂影响。不同类型应激可能造成DRN部位依赖的5-HT能神经核团激活。例如社会击败应激导致DRN背侧中部和尾端5-HT能神经核团以及DRN腹侧尾端5-HT能神经核团激活，对其他部位则缺乏明显作用（Gardner，Thrivikraman，Lightman，Plotsky，&Lowry，2005）。另一种类型的急性游泳应激可以增加mPFC 5-HT释放，而降低LS 5-HT释放（Kirby et al.，1995；Kirby，Chou-Green，Davis，&Lucki，1997）。电生理结合微透析分析进一步证实上述应激诱发的LS 5-HT释放降低由CRFl通过激活DRN背侧尾端GABA能神经元介导，CRF1受体拮抗剂阻断上述过程（Kirby et al.，1995；Roche et al.，2003）。同时DRN中间部位损毁或者选择性CRF2拮抗剂取消应激诱导的mPFC 5-HT释放增加，而CRF1拮抗剂则无此效应（Forster et al.，2008）。急性应激增加基底外侧AMG和HIP 5-HT释放（Pefialva et al.，2002），应激诱导的HIP 5-HT释放增加在CRF1敲除小鼠或慢性给与CRF1拮抗剂NBI 30775后更加显著（Pefialva et al.，2002）。另外，DRN给与CRF剂量依赖地影响腹内侧ST（伏隔核）5-HT释放。低剂量CRF抑制而高剂量CRF增加伏隔核5-HT释放。CRF1选择性拮抗剂antisauvagine-30和CRF2选择性拮抗剂预处理分别取消上述CRF剂量依赖的伏隔核5-HT释放改变，提示DRNCRF对伏隔核5-HT释放的影响依赖于DRN神经细胞CRF1和CRF2受体的不同激活（Lukkes et al.，2008）。

综上所述，在细胞分子水平CRF1和CRF2通过再分布过程构成了相互影响相互拮抗的动态调节网络。同时由于CRF受体在DRN 5-HT能和非5-HT能神经细胞分布的地形差异，它们可以通过多种作用途径介导DRN不同部位5-HT能神经核团及其投射终端的活动，以调节复杂环境条件下脑与行为的适应性改变。

3.早期环境因素对CRF受体及其

DRN-5-HT系统调节作用的影响

一般来说，个体发育通常包括孕期，哺乳期，儿童期，青少年期和成年期等不同阶段。人类和动物研究显示发育早期应激事件与发育阶段相互作用对神经发育和相关行为产生持续影响（Andersen&Teicher，2008；Leussis&Andersen，2008）。目前已建立多种拟人类早期应激动物模型，其中哺乳期母婴分离和断乳后社会隔离是目前广泛使用的两类早期应激动物模型（Lupien，McEwen，Gunnar，&Heim，2009）。

3.1早期应激动物模型

对于啮齿类动物，出生后1-21天（postnatal day，PD 1-21）为哺乳期。在这一阶段仔鼠与母鼠和和同窝仔鼠的关系构成了影响其早期发展的主要环境因素（Pryce et al.，2005；Weiss，Franklin，Vizi，&Mansuy，2011）。母婴分离是目前最常用的扰乱正常母婴关系的应激范式。为了控制在母婴分离应激过程中躯体接触以及转移操作等因素的影响，实验设计通常包括：单纯控制组（No Handling，NH）：正常饲养，除了日常清洁工作，不受其它因素干扰；早期干预组（Early Handling，EH）：短暂地分离母亲和仔鼠（一般少于15min）以保持与分离应激一致的操作过程；分离应激组（Maternal Separation，MS）：将仔鼠和母亲长时间地（3-24小时）分离（Levine，2005）。

儿童期和青少年期是个体社会关系和社会行为发展的重要阶段。对于啮齿类动物，这一发育阶段通常发生在断乳后（PD 21-28）至成年早期（PD 56-58）（spear，2000）。社会隔离（social isolation，SI）是指断乳后将动物单独饲养，隔绝与其它同伴躯体和视觉接触以及丰富环境信息刺激（Fone&Porkess，2008）。大量研究已经证实社会隔离诱导成年动物复杂的行为、神经生理和神经解剖学改变（Fone&Porkess，2008；Makinodan，Rosen，Ito，&Corfas，2012；Meng，Chen，Tong，&Zhou，2011）。

3.2早期环境因素的影响

早期环境因素对CRF受体及其DRN-5-HT系统调节作用的影响是比较新的研究领域。

仅有的几项研究显示母婴分离应激导致成年啮齿类动物DRN的CRF mRNA和CRF1 mRNA表达增加而CRF2mRNA表达降低（Lemos et al.，2011），中缝背核CRF结合率增加（Plotsky et al.，2005），提示母婴分离应激对CRF1和CRF2表达产生不同的影响，一种潜在的CRF1介导增强而CRF2介导减弱的结构性变化。另外，母婴分离应激导致大鼠DNR5-HT能投射脑区相关分子发生改变（Cirulli et al.，2009；Vfizquez，Eskandari，Zimmer，Levine，&Lopez，2002）。例如，与早期干预对照组相比，母婴分离的大鼠在青春期之前（35天）表现出前额叶、纹状体、中脑和海马内5-HT含量的显著增加，但这几个脑区内的5-HT代谢率不存在显著差异（Llorente et al.，2010）。经历母婴分离应激的成年雌性大鼠与早期干预组大鼠相比，DRN，伏隔核和杏仁核5-HT浓度显著增加（Arborelius&Eklund，2007）。上述CRF受体表达和反应性改变与母婴分离应激诱导的5-HT系统应激反应异常间的关系及其作用途径还需要进一步的研究证实。

有关断乳后社会隔离研究也显示早期应激对5-HT系统活动的持续影响。例如多数研究发现社会隔离（PD 21-63，PND 21-70，PD 21-110，PD 28-100）降低大鼠海马5-HT水平（Lapiz et al.，2003；Muchimapura，Fulford，Mason，&Marsden，2002），减少海马的5-HT能神经投射（Whitaker-Azmitia，Zhou，Hobin，&Borella，2000），但也有研究报道社会隔离（PD 49-77）增加F344大鼠海马5-HT水平（（Miura，Qiao，&Ohta，2002），提示社会隔离尤其当隔离在青少期早期（PD21-28）开始给与时通常降低海马的5-HT释放。与海马不同，PND49-77的社会隔离增加F344大鼠内侧前额叶皮质5-HT释放（Lukkes，Watt，Lowry，&Forster，2009；Miura et al.，2002），以及内侧前额叶皮质的5-HT能神经投射（Neddens et al.，2003）；而在更早期阶段给与的社会隔离（PD 28-56，PD 30-70）对SD大鼠和Lister大鼠内侧前额叶5-HT水平无影响（Brenes，Rodriguez，&Fornaguera，2008；Dalley，Theobald，Pereira，Li，&Robbins，2002）。社会隔离对杏仁核5-HT释放的影响目前尚不清楚。一项研究显示社会隔离（PND30-110）增加基底外侧杏仁核的5-HT能神经纤维投射（Lehmann，Lesting，Polascheck，&Teuchert-Noodt，2003）。上述证据提示社会隔离对不同5-HT能神经投射脑区的5-HT释放产生不同的影响，其效应可能受不同研究采用的隔离时间长短，隔离开始阶段，检测目标脑区和种系等多种因素的影响。

近期的一项研究调查了社会隔离诱导的DRN-5-HT系统活动异常与CRF受体分布和反应性改变间的关系。青少期（PD21-42）社会隔离改变成年动物DRN-5-HT系统的双阶段反应模式。DRN注射低剂量CRF降低群养动物伏隔核5-HT释放，但对社会隔离动物缺乏上述影响。与此相反，高剂量CRF同时增加群养对照动物和社会隔离动物伏隔核5-HT释放，但后者的5-HT反应更加持久（Lukkes，Summers，Seholl，Renner，&Forster，2009），提示隔离应激降低CRFl而增强CRF2介导的DRN-5-HT系统反应。与此一致，与群养对照组相比社会隔离组动物DRN的CRF2受体表达水平明显增加，CRF2激活所致胞内信号转导反应持续增强（Lukkes，Vuong，Scholl，Oliver，&Forster，2009）。上述断乳后社会隔离诱导的CRF受体改变模式与母婴分离应激的结果明显不同（Fone&Porkess，2008；Lukkes，&Watt et al.，2009），提示以往报道的两种早期应激对5-HT系统活动的影响差异可能由其对CRF受体的不同影响介导。

目前有关早期应激诱导的CRF受体及5-HT系统活动改变的行为表型特征研究十分匮乏。最近的一项研究显示社会隔离组动物CRF2介导的DRN-5-HT系统反应增强与高焦虑行为相关，CRF2而非CRF1受体拮抗剂逆转社会隔离诱导的上述改变（Bledsoe，Oliver，Scholl，&Forster，2011）。一项早期研究也发现，社会隔离（PD21-PD63）增强成年大鼠足电击和条件化电击诱导的伏隔核5-HT释放和恐惧焦虑行为（Fulford&Marsden，1998）。总的来说，尽管不同早期应激模式都能持续影响CRF受体分布和反应性并导致受其调节的DRN-5-HT系统活动异常，但其影响特征和作用模式存在差异。研究上述差异的行为学后果可以为认识发育阶段相关的早期应激对脑与行为的影响提供新的证据。

3.3早期环境因素和遗传因素交互作用的影响

CRF受体的结构和功能受遗传因素的影响。例如DRN表达更高水平CRF2的Wistar Kyoto（WKY）大鼠或者条件化诱导CRF2过表达小鼠DRN5-HT能神经元的激活水平和放电率均增加（Neufeld-Cohen et al.，2012）。新近的一项研究发现，早期环境因素对不同遗传背景大鼠（WKY和Wistar）应激反应的影响存在差异。母婴分离应激只增加WKY动物DRN CRF mRNA，同时经历分离应激的WKY鼠DRN的CRF2 mRNA与对照组相比降低（Bravo，Dinah，&Cryan，2011），提示早期环境因素对WKY遗传易感动物的影响更加显著，反映了一种遗传和早期环境因素交互作用的影响。

4.小结

总的来说，CRF1和CRF2以相互影响相互拮抗的方式动态调节DRN-5-HT系统应激反应过程，提示这两种受体相对作用的调节对于协调复杂环境中DRN-5-HT系统的应激反应过程起着关键性作用。早期环境因素和遗传因素交互作用导致CRY受体的分布和反应性持续改变并造成DRN-5-HT系统反应异常，可能是导致应激反应和精神疾病易感性个体差异的重要神经基础。深入研究CRF受体系统在脑与行为发展中的作用及其介导机制，可以为精神疾病高风险个体的早期识别和早期干预药物的开发提供新的思路。