例析现代生物技术中的筛选问题

周伟

筛选是现代生物技术中培育生物新类型过程中常用的手段。研究、解析有关筛选问题的试题，可以培养同学们思维的严谨性和创造性。现将现代生物技术中的筛选问题加以分类汇总，以供参考。

一、基因工程中的筛选

为了筛选出导人了目的基因的受体细胞，一般是在培养基中加入可检测标记基因是否表达的物质，再根据受体细胞表现出的性状加以选择，有时还要考虑目的基因的导人对标记基因的影响。常用的标记基因有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。

例1 目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示：

（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_______________。

（2）pBR322分子中有单个的BarnH Ⅰ限制酶作用位点，现将经BarnH Ⅰ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复_______________键，成功地获得了重组质粒。说明_______________。

（3）为了检测上述重组质粒是否导入原本无amp^R和tet^R的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。将灭菌绒布按到培养基上。使绒布面沾上茵落，然后再将该绒布按到含四环素的培养基上，经过培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。与图三空圈相对应的图二中的茵落表现型是_______________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_______________。

解析 （1）质粒上的抗性基因可作标记基因，便于鉴定受体细胞中是否导人目的基因。

（2）DNA连接酶能连接磷酸二酯键。经BamH Ⅰ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因能连接起来，说明这两种酶切割获得的黏性末端相同。

（3）进行导入操作时，普通质粒和重组质粒都可能导入受体细胞，而目的基因自连的环状物无法导入。在导入操作后存在三种受体细胞的混合物：多数没有导人任何质粒的受体细胞（普通受体细胞）、很少导入pBR322质粒的受体细胞（不含目的基因）和导人重组质粒的受体细胞（获得目的基因）。图二中的菌落能抗氨苄青霉素，将灭菌绒布按到图二中培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到图三含四环素的培养基上培养，仍能生长的也能抗四环素，空圈为不能抗四环素的（只能抗氨苄青霉素）。图三结果显示，多数大肠杆菌既能抗氨苄青霉素，又能抗四环素，说明导入的是pBR322质粒，而不是重组质粒（重组质粒的四环素抗性基因被切断，不能表达，因此含重组质粒的大肠杆菌只抗氨苄青霉素）。

答案 （1）筛选（鉴别目的基因是否导入受体细胞） （2）磷酸二酯两种限制酶（BamH Ⅰ和BgtⅡ）切割得到的黏性末端相同 （3）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素pBR322质粒

二、植物细胞工程中的筛选

对杂种植物细胞的筛选，常用方法分析如下：①细胞系互补选择法：包括叶绿体缺失互补、营养缺陷互补和抗性互补等；②物理特异性差异选择法：利用两个原生质体的物理特异性差异的选择，包括原生质体的大小、颜色、浮密度等的不同进行选择；③生长特异性差别选择法：根据两种原生质体亲本的生长特异性来选择。

例2

右图为细胞融合的简略过程（只考虑两个细胞的融合），若A、B是基因型分别为rrHH、RRhh两个烟草品种产生的花粉，且这两对基因位于非同源染色体上，由于一对隐性纯合基因（rr或hh）的作用，在光照度大于800 lx时，都不能生长。

（1）实验开始时必须用_______________除去不利于原生质体融合的物质。

（2）实验中除获得杂种细胞外，还有基因型为_______________的融合细胞。

（3）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，方法：_______________。

解析 （1）利用酶的专一性，既能有效去除细胞壁，又不损害原生质体；

（2）融合细胞可以是同种的两个细胞融合（基因型为rrHH或RRhh），也可是不同种的两个细胞融合（基因型为RrHh）；

（3）基因型为rrHH或RRhh融合细胞不能在大于800 lx光照下生长，杂种细胞（RrHh）能在大于800 lx光照下培养，能增殖分化。

答案 （1）纤维素酶和果胶酶 （2）rrHH、RRhh （3）置大于800 lx光照下培养，收集分化的细胞团

三、单克隆抗体制备中的筛选

在单克隆抗体制备过程中有两次筛选：第一次筛选是B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，形成B淋巴细胞一B淋巴细胞、骨髓瘤细胞一B淋巴细胞、骨髓瘤细胞一骨髓瘤细胞以及未融合的亲本细胞等多种细胞成分，从混合细胞中选出杂交瘤细胞；第二次筛选是从杂交瘤细胞中进一步选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。第一次筛选通常在HAT培养基中进行，利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞。第二次筛选最常用的方法是有限稀释法，其基本过程为：将处于对数期的杂交瘤细胞用培养液充分稀释后，接种在多孔的培养板中，然后用酶联免疫吸附试验测定。

例3

下图表示用生物工程制备人抗A抗体的过程。请回答下列问题：

（1）人的红细胞膜表面有被称为凝集原的特异_______________：从免疫学角度看，这种凝集原是_______________。

（2）图中细胞中1是小鼠体内注入人A型血红细胞后而获得的_______________细胞，这种细胞具有产生_______________的特点，但难以在体外培养。甲培养皿中培养的细胞2，是从患骨髓瘤的小鼠体内获取的骨髓瘤细胞，这种细胞在体外培养时能_______________，但不会产生抗体。

（3）为了能充分发挥上述两种细胞各自的特点，经特殊处理，在促细胞融合因子的作用下，两种细胞发生融合，形成图中的细胞3，这种细胞称为_______________。把它在乙培养皿中进行培养，则能产生大量的细胞群，这种方法称为_______________。

（4）过程①的主要目的_______________。通过过程②或③的培养方法能产生大量_______________抗体。

解析 （1）根据对细胞膜组成成分分析，膜上具有特异性的物质是糖蛋白或蛋白质，而红细胞表面的凝集原具有细胞识别功能、位于细胞膜外表面，因此推测凝集原最可能是一种糖蛋白，这种特异糖蛋白，在免疫学上称为抗原。

（2）依据单克隆抗体制备过程分析，图中1应代表从经使用人A型血红细胞免疫的小鼠体内获得能产生抗A抗体的效应B细胞（或称免疫B细胞），由于效应B细胞是高度分化的细胞，不能分裂。图中2代表骨髓瘤细胞，它具有在体外无限增殖的特点。图中3代表两类细胞融合形成的杂交瘤细胞。细胞通过增殖产生大量子细胞群过程称为克隆。

（3）由于融合得到的不一定是能产生抗A抗体的杂交瘤细胞，因此细胞融合后，还要经过筛选，将筛选获得的杂交瘤细胞经体内或体外培养，最终可以大量产生抗A抗体。

答案 （1）糖蛋白 抗原 （2）免疫B淋巴 单一的抗A抗体（或单一的特异性抗体）快速大量增殖 （3）杂交瘤细胞单克隆 （4）筛选出能产生单一抗A抗体的杂交瘤细胞抗A单克隆

巩固练习

1.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ）。

①B淋巴细胞；②小鼠骨髓瘤细胞；③B淋巴细胞自身融合细胞；④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞；⑤杂交瘤细胞。

A.①②③④ B.①③⑤ C.②④ D.②③

解析单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合时，发生了以下三种情况：未发生融合的细胞（B淋巴细胞、小鼠骨髓瘤细胞）、自身融合的细胞（B淋巴细胞自身融合、小鼠骨髓瘤细胞自身融合）以及骨髓瘤细胞与单个淋巴细胞融合的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞是制备单克隆抗体所必需的，因此，将其筛选出来。本题考查的是杂交瘤细胞筛选的机理和方法。

答案 A

2.研究人员想将生长激素基因通过质粒导入大肠杆菌细胞内，以表达产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，且目的基因不插入到基因A、B中，而大肠杆菌不带有任何抗性基因。则筛选获得“工程菌”的培养基中的抗生素首先应该（ ）。

A.仅有链霉素

B.仅有抗氨苄青霉素

C.同时含链霉素和抗氨苄青霉素

D.无链霉素和抗氨苄青霉素

解析 在基因工程中，目的基因是否导入受体细胞中，主要根据载体质粒上的标记基因确定的。根据题意，目的基因没有插入到基因A、B中，说明这两个标记基因没有被破坏，抗链霉素基因和抗氨苄青霉素基因都能表达，所以应该用同时含有链霉素和抗氨苄青霉素的选择培养基进行筛选。

答案 C