响应面法优化佛手总黄酮提取工艺

刘玉芬　夏海涛

摘要：以乙醇溶液为提取溶剂从佛手（Citrus medica var. sarcodactylis）中提取总黄酮，在单因素试验的基础上以佛手总黄酮提取率为指标，选择提取温度、提取时间和液料比3个因素进行Box-Behnken中心组合试验，优化佛手总黄酮的提取工艺条件。结果表明，优化的提取工艺条件为体积分数60%的乙醇溶液作提取溶剂、提取温度69 ℃、提取时间1.9 h、液料比V乙醇∶m佛手粉=32∶1 （mL/g）、提取2次，该条件下佛手总黄酮提取率为0.565 9%。

关键词：佛手（Citrus medica var. sarcodactylis）；总黄酮；提取工艺；响应面法

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1634-04

佛手（Citrus medica var. sarcodactylis）又名佛手柑，为常绿小乔木或灌木，是芸香科柑橘属植物香橼（C. medica）的变种，主要分布在我国浙江、广东、广西、福建、云南、四川和安徽等地，是传统的名贵中药材，全株均可入药[1-3]。佛手果性味辛、苦、甘、温，无毒，入肝、脾、胃、肺经，具有和胃健脾、舒肝理气、止咳化痰之功效，主治肝郁气滞、饮食不振、胃腹胀满、呕吐、咳嗽痰多、妇科疾病等[4-6]。研究表明佛手果中主要含有蛋白质、维生素、黄酮、多糖、香豆素类及其聚合体、有机酸、挥发油、矿物质等化学成分[7-11]，对防治胃癌、肝癌、肺癌，抑制肿瘤生长，扩张冠状血管、增加冠脉的血流量，减缓心率和降低血压，激活免疫细胞、改善机体免疫功能等也具有一定的功效[12-14]。目前对采用超声波法等对佛手总黄酮进行提取的研究已有报道[15，16]。本研究以乙醇溶液为浸提溶剂，在单因素试验的基础上应用响应面法对佛手总黄酮提取工艺条件进行优化，为进一步开发佛手产品和深入研究佛手化学成分的药理作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中药佛手原产地为广东，购自安徽省亳州市药材市场，在电热恒温鼓风干燥箱中60 ℃烘干至恒重，粉碎过20目筛。用石油醚浸泡去色，重复3次，余下的固体粉末挥发干备用。乙醇、石油醚等试剂购自国药集团化学试剂有限公司（上海），芦丁标准品购自中国药品生物制品鉴定所。

主要试验设备有UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）、RE-5285A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）、TDL-4型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 佛手总黄酮提取工艺流程 称取佛手干粉5 g，置于三口瓶中，按试验设计条件加入一定量的乙醇溶液在一定温度下浸泡提取一定时间，离心并收集提取液，减压浓缩后定容，测定提取液中的总黄酮含量。

1.2.2 佛手总黄酮提取率的测定 以芦丁为标准品，参照文献[17]得到芦丁质量浓度（C）在5～40 mg/L范围内对其在363 nm波长处吸光度（A）的标准曲线回归方程为A=0.005 6+0.029 0C，r=0.999 8。测定佛手总黄酮提取液的吸光度A363 nm，计算其中的总黄酮含量，由下式得到佛手总黄酮的提取率。

佛手总黄酮提取率=提取液中总黄酮含量×稀释倍数×体积/原料质量×100%。

1.2.3 单因素试验 设置单因素试验分别考察乙醇溶液体积分数、液料比（V乙醇∶m佛手粉，mL/g，下同）、提取温度、提取时间和提取次数对佛手总黄酮提取率的影响。①乙醇溶液体积分数。在提取温度70 ℃、提取时间1 h、液料比25∶1、提取1次的条件下，分别以体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液作为提取溶剂。②提取时间。在提取温度70 ℃、液料比25∶1、提取1次、体积分数60%的乙醇溶液作提取溶剂的条件下，提取时间分别为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h。③提取温度。在液料比25∶1、提取1次、体积分数60%的乙醇溶液作提取溶剂、提取时间1 h的条件下，提取温度分别为50、60、70、80、90 ℃。④液料比。在提取1次、体积分数60%的乙醇溶液作提取溶剂、提取时间1 h、提取温度70 ℃的条件下，液料比分别为10∶1、20∶1、25∶1、30∶1、40∶1。⑤提取次数。在①～④优化的条件下分别提取1、2、3次。

1.2.4 Box-Behnken 试验设计 在单因素试验的基础上确定Box-Behnken设计的自变量，以佛手总黄酮提取率为响应值，通过响应面分析对提取条件进行优化。试验因素水平编码设计见表1，数据采用Design Expert 8.05统计软件分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇溶液体积分数对佛手总黄酮提取率的影响 在提取温度70 ℃、提取时间1 h、液料比25∶1、提取1次的条件下，加入不同体积分数的乙醇溶液提取总黄酮，结果见图1。由图1可知，佛手总黄酮提取率随乙醇溶液体积分数的增大先升高，在乙醇溶液体积分数为60%时总黄酮提取率最高，之后再增加乙醇溶液体积分数，总黄酮提取率下降。乙醇溶液体积分数过高时会使脂溶性和醇溶性杂质溶出量增大，导致总黄酮提取率下降，故乙醇溶液体积分数选择60%为宜。

2.1.2 提取时间对佛手总黄酮提取率的影响 以体积分数60%的乙醇溶液作为提取溶剂，考察不同提取时间对总黄酮提取率的影响，结果如图2所示。由图2可知，总黄酮提取率随提取时间的延长先升高，提取时间超过2.0 h时总黄酮提取率不再升高，反而略有下降，因此，提取时间不能过长，以2.0 h为宜。

2.1.3 提取温度对佛手总黄酮提取率的影响 提取温度对总黄酮提取率的影响结果如图3所示。由图3可知，总黄酮提取率随着提取温度的升高呈先升高后下降的趋势，提取温度为70 ℃时总黄酮提取率最高，提取温度过低不利于黄酮类物质的溶出，温度过高则有可能导致黄酮类物质被分解，因此提取温度以70 ℃左右为宜。

2.1.4 液料比对佛手总黄酮提取率的影响 不同液料比对总黄酮提取率的影响结果如图4所示。由图4可知，佛手总黄酮提取率随提取溶剂用量的增大也呈先升高后下降的趋势，V乙醇∶m佛手粉=30∶1 （mL/g）时总黄酮提取率最大。提取溶剂用量少则黄酮提取不完全，而溶剂用量增大会导致成本增加，因此以V乙醇∶m佛手粉=30∶1为宜。

2.1.5 提取次数对佛手总黄酮提取率的影响 提取次数对总黄酮提取率的影响结果见图5。由图5可知，总黄酮提取率随提取次数的增加呈上升趋势，但提取次数由2次增加到3次，总黄酮提取率升高的幅度不大，综合考虑经济因素及减少操作环节，以重复提取2次为宜。

2.2 响应面优化试验结果

在单因素试验基础上设计响应面试验进一步考察提取温度、提取时间和液料比3个因素对佛手总黄酮提取率的影响，结果见表2。将所得的试验数据采用Design Expert 8.05软件进行多元回归拟合，得到总黄酮提取率对提取温度（A）、提取时间（B）、液料比（C）的二次多项回归方程Y=0.566 0

-0.009 2A-0.005 7B+0.007 7C-0.007 6AB+0.012 7AC-0.004 8BC-0.025 6A2-0.033 7B2-0.016 1C2。对该回归模型进行方差分析，结果见表3。由表3可知，模型P<0.000 1，表明响应回归模型达到了极显著水平，失拟项P=0.638 5>0.05，不显著，模型的校正确定系数R2=0.992 1，修正相关系数R2Adj=0.981 9，表明该方程较好地反映了提取温度、提取时间和液料比对佛手总黄酮提取率的影响，可用此模型对佛手总黄酮的提取进行分析和预测。由方差分析结果知，除交互项BC对总黄酮提取率影响显著（P<0.05）外，其他项的影响均达极显著水平（P<0.01）。

回归模型的响应曲面见图6。在所选试验条件范围内存在响应面最高点。由图6a可知，当液料比固定为30∶1时，总黄酮提取率随提取温度和时间的增加先呈上升趋势，提取温度和时间分别为68.47 ℃和1.94 h时总黄酮提取率最大，此后有所下降。高温环境下黄酮类物质易于氧化，结构被破坏，提取时间过长，黄酮浸出率达到动态平衡，杂质的溶出量增加，也导致总黄酮提取率下降。由图6b可知，固定提取时间为2 h，在V乙醇∶m佛手粉=32.12∶1（mL/g）、温度为68.37 ℃时可以达到响应值最高点。图6c表明固定提取温度为70 ℃，在V乙醇∶m佛手粉=32.65∶1（mL/g）、提取时间为1.87 h附近可以达到响应值最高点。各两因素交互作用的等高线均呈椭圆形，表明各两因素交互作用较强，影响显著[18]。

通过软件Design-Expert求解回归方程，得到佛手总黄酮的最佳提取工艺条件为提取温度68.85 ℃、提取时间1.91 h、V乙醇∶m佛手粉=32.06∶1（mL/g），佛手总黄酮提取率理论最高值可达0.567 5%。考虑实际操作情况，将试验条件修改为提取温度69 ℃、提取时间1.9 h、V乙醇∶m佛手粉=32∶1（mL/g）。在此条件下以体积分数60%的乙醇溶液作提取溶剂，提取2次，重复3次，所得佛手总黄酮提取率为0.565 9%，与预测值偏差很小，证明该模型用于优化筛选佛手总黄酮提取工艺是可行的。

3 小结与讨论

在单因素试验基础上利用响应面法建立了佛手总黄酮提取率与提取温度、提取时间和液料比的二次多项回归模型，优化得到的最佳提取工艺修正条件为提取温度69 ℃、提取时间1.9 h、V乙醇∶m佛手粉=32∶1（mL/g）。经验证该模型拟合程度高，准确有效。在此条件下得到的实际佛手总黄酮提取率与预测值基本吻合，说明Box-Behnken 设计法用于中药佛手中总黄酮提取工艺的优化是可行的。

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