红花蜂花粉多糖提取工艺的优化及其抗氧化性质研究

左绍远　钱金栿

摘要：采用水提醇沉法从红花（Carthamus tinctorius L.）蜂花粉中提取多糖，以多糖提取率为指标，设计正交试验优化多糖提取的工艺条件，并观察红花蜂花粉多糖在体外的抗氧化作用。结果表明，红花蜂花粉多糖的最佳提取工艺条件为提取温度90 ℃、提取时间12 h、料水质量比1∶15；此工艺条件下多糖平均得率为2.35%。体外抗氧化结果表明，红花蜂花粉多糖对羟基自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2-·）有一定的清除作用。

关键词：红花（Carthamus tinctorius L.）蜂花粉多糖；提取；正交试验；抗氧化

中图分类号：S646；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1631-03

红花（Carthamus tinctorius L.）为菊科红花属一年生草本植物，味辛、性温，具有活血通经、祛瘀止痛等功效[1，2]，是一种传统中药。红花在中国的人工种植历史悠久，新疆维吾尔自治区、云南省和四川省是红花的主产区，尤其在滇西地区红花已大量推广种植，成为新的蜜源植物，红花蜂花粉的产量逐年上升，已成为滇西地区新的农业产业之一。多糖是一类结构复杂的生物大分子物质，具有多种复杂的生物学活性。研究表明，不同来源的多糖具有增强机体免疫力、调节血糖、降血脂及抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种活性[3，4]，多糖类已成为功能性食品和新药物资源的研究热点之一。目前对蜂花粉多糖研究较多[5]，但关于红花蜂花粉多糖的研究少见报道。为综合开发利用云南省丰富的红花蜂花粉资源，对红花蜂花粉多糖的分离提取工艺及其体外抗氧化活性进行了研究，以期为扩大红花蜂花粉的用途及促进红花蜂花粉深加工产品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

D-葡萄糖标准品为Sigma公司产品，乙醇、丙酮、乙醚等试剂为国产分析纯。破壁红花蜂花粉为云南滇峰蜂业有限责任公司产品（批号：20100902）。

主要仪器包括HH-W420/600恒温水浴箱（金坛市瑞华仪器有限公司）、AG 135电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）、RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、FD-1型冷冻干燥机（北京博医康技术有限公司）、UV2550型紫外可见分光光度计（日本岛津苏州仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制[6] 精确称取在105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100.0 mg置100 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解后定容至100 mL，得葡萄糖标准储备液。吸取储备液10.0 mL置100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，得葡萄糖标准应用液（100 μg/mL）。精确吸取应用液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80 mL，分别置于具塞试管，加蒸馏水补至2.0 mL，加质量分数6.0%的苯酚1.0 mL，各管迅速加5.0 mL浓H2SO4，摇匀，沸水加热10 min，迅速流水冷却，另取2.0 mL蒸馏水同法操作，加入试剂作空白对照，在490 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标、葡萄糖质量浓度为横坐标绘制标准曲线，葡萄糖质量浓度（C）在10～80 μg/mL范围内与吸光度A490 nm有较好的线性关系，回归方程为A=0.006 1C+0.007 2，r2=0.998 4。

1.2.2 红花蜂花粉多糖的提取工艺流程与多糖提取率的测定 称取破壁红花蜂花粉150.0 g，分别用石油醚、95%（体积分数，下同）的乙醇回流2次，每次2 h。滤渣加蒸馏水水浴浸提2次，合并滤液，减压浓缩至适当体积后加95%的乙醇至乙醇体积分数为75%，醇沉，置4 ℃过夜，离心，沉淀用Sevage法脱蛋白[6]至280 nm处无明显吸收峰后再次醇沉，沉淀用蒸馏水透析12 h，醇沉，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，-20 ℃冷冻干燥至恒重，得红花蜂花粉粗多糖样品，置玻璃干燥器中备用。精确称取红花蜂花粉粗多糖样品100.0 mg，按“1.2.1”方法操作，测定吸光度。根据葡萄糖标准曲线计算出粗多糖样品中多糖的质量分数。

多糖提取率=多糖质量分数×粗多糖样品质量/蜂花粉质量（干重）×100%

1.2.3 正交试验 选择提取时间、提取温度、料水质量比为考察因素，采用L9（34）正交试验表设计试验（表1），以红花蜂花粉多糖提取率为考察指标，筛选最佳提取条件。

1.2.4 红花蜂花粉多糖对羟基自由基（·OH）的清除作用[7，8] 将多糖样品配制为浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/mL的溶液，各取1.0 mL，分别加入9.0 mmol/L FeSO4、9.0 mmol/L水杨酸-乙醇各1.0 mL，对照组以蒸馏水1.0 mL代替多糖溶液。最后加8.8 mmol/L H2O2启动反应，37 ℃水浴反应0.5 h后以蒸馏水调零，在510 nm波长处测定吸光度。以不加H2O2的多糖溶液作为本底管，维生素C作阳性对照品，同法操作。每个质量浓度做3个平行管，结果取平均值。

清除率=（A0-Ax-Ax0）/A0×100%

式中，A0为对照组吸光度，Ax为多糖样品吸光度，Ax0为本底管吸光度。

1.2.5 红花蜂花粉多糖对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除作用 采用邻苯三酚自氧化法进行测定[9，10]。多糖样品溶液配制同“1.2.4”，取pH 8.2的Tris-HCl缓冲液0.50 mL于具塞试管，加不同质量浓度的多糖溶液1.0 mL置25 ℃水浴保温20 min后，再加入在25 ℃预热的5.0 mmol/L邻苯三酚溶液0.5 mL，混匀后25 ℃水浴4 min，快速摇匀，在325 nm处以pH 8.2的Tris-HCl缓冲液调零，每隔30 s测定1次吸光度，连续测定4 min，计算加入多糖样品后的自氧化速率△Ax。空白对照组以1.0 mL蒸馏水溶液代替多糖样品，测定自氧化速率△A0。以维生素C作阳性对照同法操作。

自氧化速率=（最后一次测定的吸光度-第一次测定的吸光度）/4

清除率=（△A0-△Ax）/△A0×100%

2 结果与分析

2.1 红花蜂花粉多糖提取正交试验结果

红花蜂花粉多糖提取正交试验结果见表2。由极差分析可知各因素对多糖提取率的影响由大到小依次为提取温度、提取时间、料水质量比。最佳试验组合为A3B3C3，即提取温度90 ℃、浸提时间12 h、料水质量比1∶20。方差分析结果表明提取温度和提取时间对提取率的影响显著（P<0.05），而料水质量比对提取率的影响不显著（P>0.05）。这可能是由于原料为破壁蜂花粉，水溶性多糖容易浸出，故料水质量比对提取率的影响相对较小。由于增加提取剂水的用量会使后续减压浓缩、醇沉等工艺的成本增加，故从实际出发，本试验选择料水质量比为1∶15，此条件下红花蜂花粉多糖的提取率为2.386%，高于其他正交试验组合的结果。进行验证试验，重复3次，多糖提取率分别为2.38%、2.27%、2.41%，平均提取率为2.35%（RSD=2.56%），表明优化的工艺组合具有较高的提取率，工艺稳定可行。

2.2 红花蜂花粉多糖对·OH的清除作用

红花蜂花粉多糖对·OH的清除试验结果见图1。从图1可以看出，在试验范围内红花蜂花粉多糖和维生素C对·OH的清除率随其质量浓度的升高而上升。质量浓度低于0.30 mg/mL时，多糖对·OH的清除率较低，而多糖质量浓度从0.30 mg/mL增加到0.40 mg/mL，清除率从10.50%迅速上升至36.56%，在质量浓度为0.60 mg/mL时，多糖对·OH的清除率为56.23%，是相同质量浓度阳性对照品维生素C对·OH清除率的74%。

2.3 红花蜂花粉多糖对O2-·的清除作用

红花蜂花粉多糖对O2-·的清除试验结果见图2。由图2可知，在试验范围内，随红花蜂花粉多糖和维生素C质量浓度的增加，其对O2-·的清除率逐渐上升，且呈一定的剂量效应关系。在多糖质量浓度为0.60 mg/mL时，其对O2-·的清除率为47.36%，是相同质量浓度阳性对照品维生素C对O2-·清除率的64%。

3 小结与讨论

本试验考察了水提醇沉法提取红花蜂花粉多糖的工艺条件，优化的工艺条件为提取温度90 ℃、提取时间12 h、料水质量比1∶15，在该条件下多糖提取率为2.35%，为红花蜂花粉多糖的开发和利用提供了试验依据。体外抗氧化活性试验表明，红花蜂花粉多糖具有一定的清除·OH和O2-·的作用，且在试验范围内其清除能力随多糖质量浓度升高而增强，呈现出一定的剂量效应关系。但在相同的质量浓度下，多糖对·OH和O2-·的清除率低于维生素C，表明多糖在体外的抗氧化能力弱于维生素C。但多糖作为一种纯天然抗氧化物质，具有毒副作用小、来源广等特点，因而可长期使用[11，12]。有关红花蜂花粉多糖的生物学活性及单糖组成、结构等尚待进一步研究。

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