黑曲霉柠檬酸积累代谢机制研究进展

郭睿等

摘要：柠檬酸是能量代谢的产物，只有在阻止正常代谢进行的情况下柠檬酸才可能大量积累。20世纪30年代人们已经初步掌握了黑曲霉（Aspergillus niger）柠檬酸的发酵条件并进行规模化生产，然而对柠檬酸积累机理的研究还不是很透彻，黑曲霉柠檬酸积累引起了众多研究者的关注。另外，一些新的生物技术如基因组学技术的应用也为黑曲霉柠檬酸代谢的深层研究提供了可能。综述了黑曲霉柠檬酸代谢过程中己糖的输送、糖酵解和能荷调节机制的研究进展。

关键词：黑曲霉（Aspergillus niger）；柠檬酸积累；代谢机制

中图分类号：TQ921+.1；TS261.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1489-04

柠檬酸（2-羟基-丙烷-1，2，3-三羧酸）最初被认为是柑橘属植物的一种组分，作为三羧酸循环（TCA）的中间产物被发现已经近70年。柠檬酸结合低毒、可口性和美味于一体，已成为一种广泛的食品添加剂。并且柠檬酸能够螯合铁、铜等重金属离子，因此在金属离子催化的氧化反应过程中，对油、脂肪和抗坏血酸的稳定性具有重要的作用，已被广泛应用于医药和化妆品行业中[1]。

目前，柠檬酸全世界消耗量已达120万t，年产量达160万t，市场贸易量为90万t以上，且每年以7%的速度递增。虽然柠檬酸有一小部分在酵母发酵中产生，但大多数发生在真菌黑曲霉（Aspergillus niger）中。数十年来，黑曲霉积累柠檬酸的生化代谢机制引起了基础科学和应用科学研究者的广泛关注，并开展了大量研究。本文结合近些年来黑曲霉合成柠檬酸代谢机制的研究进展，对其进行总结概括，以求更深入理解其内在机理。

1 黑曲霉合成柠檬酸的途径

自1940年TCA学说建立以来，柠檬酸的发酵机理逐渐被人们所认识。Cleland等[2]的研究表明柠檬酸的合成过程包括葡萄糖酵解的分解代谢。由于柠檬酸合成酶位于线粒体中，合成的草酰乙酸并不立即参与柠檬酸合成酶的反应，而是首先被细胞质中的苹果酸脱氢酶催化形成苹果酸，进而通过苹果酸-柠檬酸反向转运进线粒体（图1）。由图1可知，柠檬酸是整个TCA代谢过程中的中间产物。在柠檬酸积累过程中，只有当黑曲霉顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶活性很高时才有利于柠檬酸的大量积累。

2 黑曲霉合成柠檬酸的代谢调控

2.1 葡萄糖的吸收

对于柠檬酸发酵，由于黑曲霉在以葡萄糖和果糖为碳源时能够很好地生长，所以通常采用己糖为碳源。对于工业用蔗糖，一般采用在低pH条件下高温灭菌或者利用细胞外的转化酶水解为单糖。葡萄糖吸收主要依靠两种亲和性不同的运载体的被动扩散作用。Vankuyk等[3]发现了一个由mstA编码的高亲和性的运载体，碳源浓度较低时该高亲和性运载体就能够生成，它能够催化单糖/H+交换，其Km值为25±10 μmol/L，试验发现pH降低或者柠檬酸浓度升高会影响该运载体的活性。

葡萄糖达到15%（W/V）时，黑曲霉内除高亲和性运载体外，还生成一种低亲和性的运载体，该低亲和性运载体受pH和柠檬酸的影响比高亲和性运载体要小。低亲和性运载体的Km值为360 μmol/L，远比高亲和性运载体大。借助同源构巢曲霉的基因分析发现，低亲和力运载体可能有mstE基因编码，mstE基因的表达随葡萄糖浓度的升高而加强。

需要说明的是，这两种运载体提供的是促进扩散而非主动运输。促进扩散和主动运输均与底物葡萄糖浓度呈非线性关系，但是简单扩散却是线性关系。Wayman等[4]的试验发现葡萄糖的吸收率与葡萄糖浓度为简单的线性关系而不是非线性模式。即使底物中柠檬酸的浓度很高，且这种高浓度的柠檬酸对运载体有抑制作用，但葡萄糖吸收的速率却不受限制[5]。

2.2 糖酵解的调节

发酵初期磷酸戊糖途径占主要部分，黑曲霉生长期间几乎全部TCA酶的含量都很高，此时大量的葡萄糖被用于黑曲霉菌株的生长。24 h后开始有柠檬酸生成，如图1所示，在柠檬酸发酵初期，柠檬酸通过TCA循环转换为α-酮戊二酸。NAD-和NADP-专一性异柠檬酸脱氢酶此时具有很高的活性。可以看出，柠檬酸积累的最初阶段并没有阻断TCA循环。然而此时柠檬酸产量比理论值要高，这可能是氨基糖的瞬时积累及释放所致[6]。在柠檬酸积累的诱导期间，延胡索酸和异柠檬酸减少，丙酮酸、草酰乙酸和柠檬酸增加。这种中间产物水平的短暂变化主要是因为α-酮戊二酸脱氢酶的减少，进而导致琥珀酸、延胡索酸的水平降低。同时由于酶解作用强烈使丙酮酸和草酰乙酸增加，这为柠檬酸的积累提供了条件[7]。

糖酵解的调节可以在不同的层面上进行：转录水平调节；利用特定效应因子以及翻译后修饰调节别构酶活性[8，9]。对糖酵解调节酶基因的研究表明己糖激酶、葡糖激酶、丙酮酸激酶的合成与菌体外部环境有关，将黑曲霉置于葡萄糖和果糖碳源时能够显著激发转录过程并进而刺激这些激酶的生成。

2.2.1 己糖激酶和葡萄糖激酶 己糖的磷酸化由己糖激酶和葡萄糖激酶共同作用。但是两种酶的基因彼此孤立，动力学决定性因素也不同。在激活的碳代谢条件下，两种酶都可以组成型表达，只不过己糖激酶拥有更多的特异性底物。果糖可以被己糖激酶磷酸化，但是反应很慢，在细胞中可以忽略不计。葡萄糖激酶能够抵抗不同效应因子的抑制，但pH稍微下降即容易被破坏。另外糖浓度低时，无论果糖还是葡萄糖均能被己糖激酶磷酸化并且没有明显的先后次序。己糖激酶还可以被6-磷酸海藻糖（一种海藻糖生物合成的中间产物）强烈抑制。但6-磷酸海藻糖只存于发酵的48 h以内，在被cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）磷酸化后即被中性海藻糖酶水解。6-磷酸海藻糖的水解可以使己糖激酶不再受到抑制，大量的果糖和葡萄糖被磷酸化，并可能最终促使磷酸戊糖途径向糖酵解途径转变[10]。

2.2.2 磷酸果糖激酶 磷酸果糖激酶（PFK）是糖酵解途径中的关键酶，它催化糖酵解的第一步不可逆反应，利用Mg-ATP磷酸化果糖-6-磷酸形成果糖-1，6二磷酸并释放副产物Mg-ADP。由于PFK既能保证高的糖酵解通量又能提高细胞内柠檬酸浓度，因而受到众多研究者的关注。

磷酸果糖激酶被正常生理浓度的柠檬酸（1～5 mmol/L）所抑制。但是在发酵条件下，这种抑制作用被许多正向效应因子（NH4+，AMP，Fru-2，6-P2）所中和。碳源的浓度也可能对此有作用，这是因为处于高浓度蔗糖或者葡萄糖中的黑曲霉，其细胞内Fru-2，6-P2（磷酸果糖激酶活化因子）浓度同样会升高。用1-13C葡萄糖的NMR研究证实了果糖-6-磷酸为低糖条件下的主控步骤，但在高糖浓度下主控步骤下移到3-磷酸甘油醛脱氢酶[11]。

NH4+能有效解除柠檬酸和ATP对PFK的抑制。细胞内NH4+的浓度处于生理水平时，PFK对柠檬酸不敏感。当NH4+被消耗时溶液的pH会有所下降，这对柠檬酸发酵是有利的。

最近Legi？觢a的研究发现PFK1翻译后修饰会产生一个短的活性片段。首先通过特定蛋白酶将分子量为85 u的原蛋白水解得到无活性的49 u的片段；第二步由cAMP-依赖蛋白激酶（PKA）使蛋白分子磷酸化，从而得到短的有活性的PFK1片段[8，9]。去除具有柠檬酸结合位点的酶的C末端并保留活性N-末端部分可以使蛋白既能拥有酶的活性的同时又不受柠檬酸的抑制。与原酶相比，该活性片段被果糖-2，6-二磷酸、AMP和NH4+激活后活性更高，并且对ATP抑制作用响应不明显。同时为了避免复杂的翻译后修饰自发进行，必须对活性短的PFK1片段的编码基因进行修饰。Capuder等[12]筛选出能够改变PFK1活性的短片段然后用谷氨酸代替相应的苏氨酸终止磷酸化。修饰后的基因能够直接表达而不受柠檬酸抑制。

2.2.3 丙酮酸激酶 虽然PFK是糖酵解中最复杂的调控酶，但通常催化糖酵解的第三步不可逆反应的丙酮酸激酶控制细胞内糖酵解的速率。PKIA基因控制编码丙酮酸激酶，这种酶由分子量为58 u的单体构成。酶动力学研究进一步发现果糖1，6-二磷酸能够阻止纯化阶段丙酮酸激酶的失活。有趣的是，对丙酮酸激酶有明显抑制的ATP对6-磷酸-1-激酶却没有任何抑制，相反活性还略有提高。丙酮酸激酶一直被认为是调控柠檬酸合成阶段的重要酶，但是Meixner-Monori等[13]发现提纯后的丙酮酸激酶受到代谢程度的影响很小。并且Ruijter等[14]发现无论是单独还是同时扩增PFK1和PKIA的基因，柠檬酸积累的产率都没有增加。这可能验证了Torres等[15]的计算——必须同时至少增加7个糖酵解酶的活性才能获得较为显著的柠檬酸积累。

2.3 能荷调节

葡萄糖进行糖酵解途径会产生一定量的NADH，NADH必须及时经过电子传递转化为NAD+才能保证黑曲霉菌体内氧化还原电位的平衡。NADH泛醌氧化还原酶全部失活时才能使柠檬酸产率提高。这是由于NADH失去的电子经过呼吸链会产生ATP，过量的ATP会抑制磷酸果糖激酶的活性，不利于糖酵解的顺利进行。研究发现，黑曲霉中除了有一条正常的呼吸链外还有一条受水杨酸氧肟酸 （SHAM）抑制的侧呼吸链，黑曲霉发酵后期柠檬酸的合成主要是通过侧呼吸链完成的，缺氧会造成侧呼吸链不可逆而失活[16]。

在柠檬酸生产阶段，大量的NADH通过侧呼吸链被氧化（图2）。高活性的侧链氧化酶将多余的NADH氧化，这样不仅不会产生多余的ATP，还能够保证细胞内的氧化还原电位的平衡。侧链氧化酶是在细胞质合成后转移到线粒体中的，Hattori等[17]研究发现柠檬酸生成时侧链氧化酶仅由侧链氧化酶基因（aoxl）的转录水平调节。

ODonnell等[18]研究了氧压增强时侧NADH脱氢酶的作用，发现增加溶氧含量能够使活性氧（ROS）浓度和抗氧化酶活性快速提高，也使细胞内蛋白浓度下降，从而导致ATP下降。过量的氧环境加速了细胞的衰老和死亡。分析认为在过量溶氧条件下为了维持低浓度的ROS，侧NADH脱氢酶的活性显著增加，但是这也降低了机体合成蛋白的能力，从而无法合成足够的ATP。

3 小结与展望

荷兰工业化学公司DSM已经完成了黑曲霉基因组测序的工程[19]。黑曲霉基因组约3 390万个碱基对编码了14 000多个基因。其中大约6 500个基因的功能已被确定。未来，黑曲霉基因组可以用于设计DNA芯片，并可用来鉴定改进菌株中表达上调和下调的基因；有助于发酵成功。另外还能够检测有害参数例如Mn2+或者糖浓度以及糖类型对发酵的影响。

目前国内黑曲霉积累柠檬酸产量每年都有所提高，但柠檬酸生产时的粮耗却居高不下，柠檬酸企业在发酵技术改造研究上的投入也相对不足，借助基因组学一些新技术深入研究黑曲霉发酵柠檬酸代谢调节，可望为培育菌株提供更好的筛选策略。

参考文献：

[1] 任晓莉，赵 林，赵润柱.柠檬酸发酵生产菌种黑曲霉的选育[J].食品工业科技，2010，31（8）：151-153.

[2] CLELAND W， JOHNSON M. Tracer experiments on themechanism of citric acid formation by Aspergillus niger[J]. J Biol Chem，1954，208（2）：679-692.

[3] VANKUYK P A，DIDERICH J A，MACCABE A P，et al. Aspergillus niger mstA encodes a high-affinity sugar/H+ symporter which is regulated in response to extracellular pH [J]. Biochem J，2004，379（2）：375-383.

[4] WAYMAN F M，MATTEY M. Simple diffusion is the primary mechanism for glucose uptake during the production phase of the Aspergillus niger citric acid process [J]. Biotechnol Bioeng，2000，67（4）：451-456.

[5] TORRES N V，VOIT E O，？魣GONZ？魷LEZ-ALC？魷N C. Optimization of nonlinear biotechnological process with linear programming： application to citric acid production by Aspergillus niger[J]. Biotechnol Bioeng，1996，49（3）：247-258.

[6] PAPAGIANNI M， WAYMAN F， MATTEY M. Fate and role of ammonium ions during fermentation of citric acid by Aspergillus niger[J]. Appl Environ Microbiol，2005，71（11）：7178-7186.

[7] LEVENTE K， CHRISTIAN P K. Aspergillus niger citric acid accumulation： Do we understand this well working black box[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2003，61（3）：189-196.

[8] MESOJEDNIK S， LEGISA M. Post-translational modification of 6-phosphofructo-1-kinase in Aspergillus niger[J]. Appl Environ Microbiol，2005，71（3）：1425-1432.

[9] MLAKAR T， LEGISA M. Citrate inhibition resistant from of 6-phosphofructo-1-kinase from Aspergillus niger[J]. Appl Environ Microbiol，2006，72（7）：4515-4521.

[10] LEGISA M， MATTEY M. Changes in primary metabolism leading to citric acid overflow in Aspergillus niger[J]. Biotechnol Lett，2007，29（2）：181-190.

[11] 孙 荣，王 燕，杨平平.柠檬酸发酵现状及展望[J]. 中国调味品，2011，36（1）：90-96.

[12] CAPUDER M，SOLAR T，BENCINA M，et al. Highly active， citrate inhibition resistant form of Aspergillus niger 6-phosphofructo-1-kinase encoded by a modified pfkA gene[J]. J Biotechnol，2009，144（1）：51-57.

[13] MEIXNER-MONORI B，KUBICEK C P，R？魻HR M. Pyruvate kinase from Aspergillus niger：A regulatory enzyme in glycolysis[J]. Can J Microbiol，1984，30（1）：16-22.

[14] RUIJTER G J， PANNEMAN H， HETTY C，et al. Characterisation of the Aspergillus nidulans frA1 mutant： Hexose phosphorylation and apparent lack of involvement of hexokinase in glucose repression[J]. FEMS Microbiol Lett，1996，139（2-3）：223-228.

[15] TORRES N V，RIOL-CIMAS J M，WOLSCHEK M，et al. Glucose transport by Aspergillus niger： The low affinity carrier is only formed during growth on high glucose concentrations [J]. Appl Microbiol Biotechnol，1996，44（6）：790-794.

[16] KUBICEK C P，ZEHENTGRUBER O， HOUSAM E K，et al.Regulation of citric acid production by oxygen： Effeetof dissolved oxygen tension on adenylate levels and respiration in Aspergillus niger[J]. Microbiol Bioteehnol，1988，9（2）：101-116.

[17] HATTORI T，KINO K，KIRIMURA K. Regulation of alternative oxidase at the transcription stage in Aspergillus niger under the conditions of citric acid production[J]. Curr Microbiol，2009，58（4）：321-325.

[18] ODONNELL A，HARVEY L M，MCNEIL B. The roles of the alternative NADH dehydrogenases during oxidative stress in cultures of the filamentous fungus Aspergillus niger[J]. Fungal Biology，2011，115（4-5）：359-369.

[19] HERMAN J P， JOHANNES H W， DAVID B A，et al.Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88[J]. Nature Biotechnol，2007，25（2）：221-231.