PKB/CDC25B信号通路在卵巢上皮性癌组织中的表达及临床意义

刘辉 高志安

【摘 要】目的：从分子水平上检测蛋白激酶B和CDC25B在卵巢上皮性癌组织中表达，探讨PKB/CDC25B信号通路在卵巢癌发生发展中的意义。方法：应用western印迹方法对2010年1月至2012年12月在辽宁医学院附属第一医院进行手术治疗，经病理组织学检查确诊的20例卵巢上皮性癌组织，正常卵巢组织10例，卵巢良性肿瘤15例的PKB和CDC25B的表达进行了分析。结果：PKB 与CDC25B western印迹检测卵巢上皮性癌组织中磷酸化PKB蛋白和CDC25B蛋白与正常卵巢、卵巢良性肿瘤组织相比，差异有统计学意义（P< 0. 01）。结论：磷酸化PKB蛋白和CDC25B蛋白与卵巢上皮性癌的发生、发展呈正相关，有望成为卵巢上皮性癌生物学行为的重要指标。

【关键词】蛋白激酶B；CDC25B；上皮性卵巢癌

卵巢癌（ovarian Carcinoma）在女性生殖器恶性肿瘤中的发病率占第三位，严重威胁女性的生命和健康。尽管手术及术后化疗是治疗卵巢癌的主要手段之一，但是随着化疗耐药的不断出现，5年生存率仍徘徊在30%-50%左右[1，2]。近年来，人们对化疗耐药的机制进行了大量研究，认为可能与PI3K/Akt信号通路异常活化有关[3-5]，但此通路活化后下游底物蛋白CDC25B的表达如何变化还不清楚。本研究应用western印迹方法对卵巢上皮性癌组织的PKB和CDC25B的表达进行了分析，探讨PKB/CDC25B信号通路在卵巢癌组织中的作用。

1 材料和方法

设计：随机对照，分子生物学实验。

时间及地点：于2010年1月至2013年1月在辽宁医学院附属第一医院肿瘤学实验室完成。

材料：卵巢癌组织：2010年1月至2012年12月在辽宁医学院附属第一医院进行手术治疗，经病理组织学检查确诊的20例卵巢上皮性癌组织，正常卵巢组织15例，卵巢良性肿瘤10例。实验已得到辽宁医学院伦理委员会批准，所有患者签署了标本研究的知情同意书。

实验方法：

Western Blot方法检测PKB、CDC25B的蛋白表达：用RIPA蛋白裂解液裂解卵巢癌、

正常卵巢组织及良性卵巢肿瘤中的总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度，-20℃或-80℃保存备用。电泳前，加入2*SDS样品缓冲液，100℃煮沸5 min，离心后上样，10 %SDS- PAGE电泳分离，然后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，之后用含5%BSA的TBS（pH7.4）将滤膜于室温摇动温2 h进行封闭，封闭后的滤膜再分别与PKB（1：1000稀释）、Phospho-Akt（Ser473） （1：500稀释）、CDC25B抗体（1：1000稀释）、Phospho-CDC25B-S353 抗体（1：500稀释）和β-Actin（稀释比为1：1000） 4℃温育过夜。经TTBS洗涤后，HRP偶联的IgG作为二抗（稀释比为1：5000）室温温育2 h，洗膜后，使用ECL发光法显色。内参采用β-Actin。计算机软件Image J进行密度分析，计算灰度值。

主要观察指标： Western Blot方法检测PKB、Cdc25B的总蛋白及磷酸化蛋白表达水平。

统计学分析：应用SPSS 13. 0统计软件进行数据统计与分析，各组数据以均数±标准差（ ±s）表示，多样本均数检验采用方差分析的方法。P < 0. 05为差异有显著性意义， P < 0. 01为差异有极显著性意义。

2 结果

PKB、PKB -pS473、Cdc25B、Cdc25B –pS353的蛋白表达水平

蛋白条带分析结果表明，各组织内的PKB和Cdc25B蛋白总体水平表达一致，各组无显著性差异（P>0.05）。与正常卵巢癌组织和卵巢良性肿瘤组织相比，卵巢上皮癌组织中的磷酸化PKB -pS473和Cdc25B –pS353的表达明显增强，有显著性差异（P<0.01）。

3 讨论

蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB/Akt）是细胞信号转导过程中的一个重要的调节因子，参与调节细胞糖代谢，蛋白质合成以及细胞凋亡、增殖和存活等生命活动。PKB属于丝/苏氨酸蛋白激酶，是P3IK下游的直接靶蛋白之一[6，7]。近些年来研究发现PKB在细胞周期G1/S期和G2/M期转换过程中起重要调节作用。

CDC25 （cell division cycle 25）是Thr/Tyr双特异性蛋白磷酸酶，在细胞周期中充当重要角色。哺乳动物中三种相关的CDC25B基因产物在进化上高度保守，分别称为CDC25A，CDC25B和CDC25C。CDC25B是CDC25 蛋白家族的最重要成员，贯穿细胞周期的各阶段，由于在不同时期定位于细胞内不同的位置，故在细胞周期各期转换中起核心作用，是细胞有丝分裂的激活剂[8，9]。

在Hela细胞的研究中，PKB/Akt是CDC25B的上游激酶之一，可以将CDC25B的S353磷酸化并使其定位于胞浆[10]。近年研究发现，在卵巢癌细胞系中已分别发现存在高表达的PKB[3，5]和Cdc25B[11]。但是PKB/CDC25B信号通路对卵巢癌组织的影响在国内外还未见报道。本研究发现，PKB和CDC25B在正常卵巢、卵巢良性肿瘤及卵巢上皮性癌中的表达在蛋白总体水平无差异；磷酸化PKB蛋白和磷酸化CDC25B蛋白在卵巢上皮癌中均有过度表达， 与正常卵巢及卵巢良性肿瘤相比，其差异有显著性意义，随着对蛋白激酶PKB和CDC25B 磷酸酶研究的不断深入，人们已经认识到PKB和CDC25B可能是癌症治疗的一个潜在靶点[12]。因此，研制PKB和CDC25B抑制剂对于开发新的抗癌药物具有极其重要的意义。

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