痕量维生素B3的双水相萃取与荧光测定

李瑜 张振新

【摘要】本文分析了聚乙二醇6000-硫酸铵双水相体系对维生素 B3的最佳萃取条件，并结合荧光法对其进行测定。且在最佳萃取条件下进行荧光扫描确定最佳激发/发射峰为 λex /em=319.0nm/392.0nm。聚乙二醇 6000-硫酸铵双水相体系对维生素B3的一次性萃取率在 91%～93%之间，线性范围8.0×10-6～2.0×10-4g/L，检出限为 1.3×10-7g/L。该方法萃取率高、线性范围宽、检出限低，可维生素B3的分析测定。

【关键词】双水相萃取；荧光法；维生素【Abstract】

【中图分类号】R927 【文献标识码】A【文章编号】1004-4949（2013）09-214-01

维生素B3又称尼克酸、烟酰胺、烟酸。维生素B3能促进血液循环，降低血压，降低胆固醇和甘油三酯，减轻胃肠障碍.减轻美尼尔综合症的症状等。在动物肝脏、肾脏、瘦肉、鱼卵、麦芽、全麦制品、花生、无花果等中富含维生素B3。在维生素B3含量测定的方法中，采用双水相萃取、荧光法测定维生素B3的所占比例很小。本文选用聚乙二醇6000-硫酸铵双水相萃取、荧光法测定维生素B3，达到提高灵敏度的目的，从而进一步完善了维生素的分析与测定，为双水相的运用拓展了范围。

1实验

1.1仪器和试剂：pHS-3C 数字型精密酸度计（上海虹益仪器厂）；荧光光度计FP-8500（日本岛津）；FA2004型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）

维生素B3标准溶液6.0×10-4g/L（避光保存），聚乙二醇2000；聚乙二醇6000；氯化钠；硫酸钠；碳酸钠；磷酸二氢钠；硫酸铵；磷酸。聚乙二醇为化学纯，其余所用试剂均为分析纯。

1.2实验与方法：在60.0mL 的分液漏斗中依次加入聚乙二醇 6000 溶液（30%）6.0mL、磷酸-磷酸氢二钠缓冲液1.0mL、维生素B3标准溶液、硫酸铵1.0g、振荡1.5min、静置 8.0min，分离上下相，在 λex/λem=319.0nm/392.0nm 处测量上层水相中维生素B3的荧光值。将荧光值代入回归方程，计算维生素 B3的含量。

2结果与讨论

2.1荧光光谱：以荧光光度计 FP-8500（激发/发射缝宽 5nm/5nm）分别对维生素B3水溶液以及含有维生素B3的双水相进行扫描，结果显示，在聚乙二醇 6000～硫酸氨双水相体系中维生素B3的激发/发射峰并没有明显偏移，而维生素B3的荧光值在该体系中明显增强，这说明聚乙二醇 6000 对维生素B3具有富集作用。如图所示：A、A'--维生素B3水溶液 ，B、B'-双水相，由图可知，利用该体系测定维生素B3的最佳激发/发射波长为 λex /λem=319.0nm/392.0nm

【中图分类号】R927 【文献标识码】A【文章编号】1004-4949（2013）09-214-01

维生素B3又称尼克酸、烟酰胺、烟酸。维生素B3能促进血液循环，降低血压，降低胆固醇和甘油三酯，减轻胃肠障碍.减轻美尼尔综合症的症状等。在动物肝脏、肾脏、瘦肉、鱼卵、麦芽、全麦制品、花生、无花果等中富含维生素B3。在维生素B3含量测定的方法中，采用双水相萃取、荧光法测定维生素B3的所占比例很小。本文选用聚乙二醇6000-硫酸铵双水相萃取、荧光法测定维生素B3，达到提高灵敏度的目的，从而进一步完善了维生素的分析与测定，为双水相的运用拓展了范围。

1实验

1.1仪器和试剂：pHS-3C 数字型精密酸度计（上海虹益仪器厂）；荧光光度计FP-8500（日本岛津）；FA2004型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）

维生素B3标准溶液6.0×10-4g/L（避光保存），聚乙二醇2000；聚乙二醇6000；氯化钠；硫酸钠；碳酸钠；磷酸二氢钠；硫酸铵；磷酸。聚乙二醇为化学纯，其余所用试剂均为分析纯。

1.2实验与方法：在60.0mL 的分液漏斗中依次加入聚乙二醇 6000 溶液（30%）6.0mL、磷酸-磷酸氢二钠缓冲液1.0mL、维生素B3标准溶液、硫酸铵1.0g、振荡1.5min、静置 8.0min，分离上下相，在 λex/λem=319.0nm/392.0nm 处测量上层水相中维生素B3的荧光值。将荧光值代入回归方程，计算维生素 B3的含量。

2结果与讨论

2.1荧光光谱：以荧光光度计 FP-8500（激发/发射缝宽 5nm/5nm）分别对维生素B3水溶液以及含有维生素B3的双水相进行扫描，结果显示，在聚乙二醇 6000～硫酸氨双水相体系中维生素B3的激发/发射峰并没有明显偏移，而维生素B3的荧光值在该体系中明显增强，这说明聚乙二醇 6000 对维生素B3具有富集作用。如图所示：A、A'--维生素B3水溶液 ，B、B'-双水相，由图可知，利用该体系测定维生素B3的最佳激发/发射波长为 λex /λem=319.0nm/392.0nm

2.2双水相组分的选择、萃取时间及萃取率：在常见的盐中，能与聚乙二醇形成双水相的可溶盐多为二价阴离子的盐，如：硫酸钠、碳酸钠、硫酸铵，但硫酸钠形成的双水相不稳定，碳酸钠的需要量较大，硫酸铵形成的双水相快且稳定。一价阴离子盐很难形成双水相，磷酸盐分相较慢。故本实验选择硫酸铵与聚乙二醇形成双水相体系。

另实验发现，在聚乙二醇与硫酸铵形成的双水相体系中，聚乙二醇 6000～硫酸铵体系对维生素B3的萃取率大于聚乙二醇 2000～硫酸铵双水相体系。而且，在该体系中聚乙二醇 6000 与硫酸铵的最佳组合为：聚乙二醇 6000 溶液（30%）为6.0mL，硫酸铵1.0g。

当其它条件相同时，采用不同的时间萃取，实验结果表明，最佳时间条件为：振荡 1.5min、静置 8.0min。

2.3酸度：在几支60mL的分液漏斗中，依次加入6.0mL 30%的聚乙二醇6000溶液、1.0g硫酸铵、等量的维生素B3标准液，加入不同酸度的磷酸-磷酸氢二钠缓冲液，振荡 1.5min，静置 8.0min，分离上下相，在 λex /λem=319.0/392.0nm处测量上层水相中维生素B3的荧光值。实验结果表明，在 pH 值为 4.0～5.0 的酸度范围内时维生素B3的荧光值较大且相对稳定，因此，本实验选用 pH=4.5的缓冲液，所用缓冲液体积为 1.0mL。

2.4干扰实验：实验发现，在维生素B3的聚乙二醇6000-硫酸铵双水相体系中，允许相对误差为正负5%时，下列物质的允许倍数（维生素B3的浓度为 4×10-5g/L）至少为：葡萄糖、蔗糖、淀粉（1000）；抗坏血酸、酒石酸、柠檬酸、草酸（800）；L-谷氨酸（200）；苯甲酸（400）；水杨酸、维生素 B1、维生素 B2（100）。常见的无机盐离子不易被有机相萃取，因此不易干扰维生素B3的测定。由此可见，本方法的选择性较好。

2.5回归方程和检出限：在最佳实验条件下，按实验方法，分别取不同量的维生素B3标准溶液进行萃取实验，制作工作曲线。结果表明，维生素B3量在 8.0×10-6～2.0×10-4g/L 范围内与荧光值呈线性关系，其线性方程为： ΔF= 19.3732+6.6421C，相关系数 R= 0.9979检出限为1.3×10-7g/L。

2.6样品分析

2.6.1 维生素B复合片

把一维生素 B 复合片（0.072g，约含VB310mg），碾碎后用水溶解，并稀释定容于100mL 的容量瓶中。实验前，量取2mL的浓溶液定容于100mL的容量瓶中（浓度约为2×10-5 g/L），作为待测液。

2.6.2 花生

称取8.0g花生，碾碎后加入稀盐酸、胃蛋白酶、淀粉酶溶解，并在40度水浴中加热，过滤，定容与250mL容量瓶中。测定结果见表1

4结论

本文通过实验论证了应用高聚物～盐双水相萃取、荧光测定维生素B3的可行性，在聚乙二醇 6000～硫酸铵双水相体系中维生素B3的萃取率较高，结合高灵敏度的荧光法进行测定，能够满足痕量维生素B3的测定要求，样品分析的结果也明了这一点。与现有的维生素B3测定方法比较，此方法线性范围较宽、操作简单、检出限较低，具有一定的实用价值。

参考文献

[1] 焦庆才，刘茜，陈耀祖. 双水相萃取法从发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶的研究[J]. 高等学校，1998，19（3）：391-394

[2] 戚琦，李蕾，李 勋，赖晓绮. 聚乙二醇 800- PVP 双水相体系萃取荧光测定阿司匹林肠溶片中水杨酸[J]. 光谱实验室，2005，22（1）：103-105

[3] 陈小明. 维生素B1- 钼酸铵荧光光度法的研究与应用 [J]. 分析化学，1999，27（8）：992

[4] 杜晓光. 反相高效液相色谱法分离测定复合维生素片剂中 B1、B2、 B6.和烟酰胺[J]. 分析试验室，2006，25（3）：86-88

[5] 张振新，谢秀娟.双水相体系中B族维生素的萃取与测定. 分析实验室2011

[6] 李凯，李成付，李加友，刘茜，焦庆才. 双水相体系萃取精氨酸脱亚胺酶[J]. 精细 化工，2008，25（9）：865-868

[7] 练萍，李蕾，戚琦.PEG600-Triton X-100 组合表面活性剂双水相体系萃取测定类黄酮[J].2005，24（5）：55-58

[8] You-TingWu，MartinhaPereira，Armando Venancio&Jose Teixeira. Recoveryof endo-polygalacturonaseusingpolyethyleneglycol-salt aqueoustwo-phase extraction with polymer recycling[J]. Bioseparation，2000，9： 247-254

[9] 邓凡政，郭东方. 离子液体双水相体系萃取分离牛血清百蛋白[J]. 分析化学，2006，34 （10）： 1451-1453

[10] 刘庆芬，胡雪生，王玉红等. 离子液体双水相萃取分离青霉素[J]. 科学通报，2005，50（8）： 756-759

[11] 刘培元，王国平. 离子液体/盐双水相萃取技术的研究进展[J].化学工程与装备，2008，3：113-118，107

[12] 姜大雨，朱红，王良等.离子液体双水相萃取的应用研究进展[J]. 化学试剂，2010，32（9）：805-810

[13] 许金钩，王尊本等.荧光分析法[M].北京：科学出版社，2006：15-16

[14] 蒋淑艳.同步荧光法测定食品中维生素B1[J].光谱实验室，1997，14（2）：83-85