肝素对腹膜透析大鼠腹膜电荷屏障及蛋白质丢失的影响

腹膜透析(PD)是尿毒症的一种肾脏替代治疗方式。PD过程中蛋白质丢失是造成患者蛋白质营养不良的一个重要原因。既往研究发现，每日经PD液丢失的蛋白质约4.14±1.91g[1]，但丢失的原因目前并未完全明确。腹膜具有分子屏障及电荷屏障[2]，我们前期的临床研究及动物实验结果也发现，在尿毒症和PD两种状态下腹膜电荷屏障均受到损害，且大鼠PD液电荷屏障的变化及PD液白蛋白之间存在显著的负相关性，因此判断PD大鼠腹膜负电荷屏障被破坏，增加了白蛋白的漏出。

肝素具有负电荷，可与肾小球基膜上的负电荷互补[5]，减少尿蛋白漏出。那么，肝素是否能够改善腹膜电荷屏障，进而减少蛋白质丢失，目前均未明确，本文将对此进行研究，以便为临床防止PD蛋白质营养不良提供理论依据。

材料与方法

材料总淀粉酶和胰淀粉酶试剂盒购置英国Landox公司。淀粉酶抑制剂购置Sigma公司。

实验动物体重为160～180g的SPF级雄性SD大鼠40只(上海斯莱克实验动物有限责任公司)。随机分为4组：(1) 尿毒症组(n=10)：5/6肾切除制作尿毒症大鼠模型，应用生理盐水10 ml/次，2次/d行PD。(2) PD组(n=10)：制作尿毒症大鼠模型，建模后制作PD大鼠模型[6];应用百特PD液进行PD，10 ml/次，2次/d。(3)对照组(假手术组，n=10)，即未切除肾脏的大鼠,也采用生理盐水10 ml/次，2次/d行PD。(4)肝素组(n=10)，10 ml PD液加普通肝素1 mg/(kg·次)，2次/d[7]。

所有大鼠PD 4周后收集血清及PD液，测定血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)及淀粉酶。同时在PD进行2h后留取10 ml PD液，并收集24h PD液计量(Pv)，测定PD液蛋白(Pp)。

电荷屏障的测定采用清除法测定血清、PD液总淀粉酶及胰淀粉酶，具体方法见试剂盒(分别为 Stam、Ptam、Spam和Ppam)。 血清和PD液唾液淀粉酶(Ssam和Psam)的计算参照O’Donnell 等方法进行[7]。

电荷屏障的计算：分别计算PD对pam的清除率(Cpam)和sam的清除率(Csam)，即Camy=(PD液淀粉酶浓度×Pv)/血液淀粉酶浓度。再将Cpam/Csam作为评价腹膜电荷屏障的指标。

统计学分析所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，相关性分析采用Spearman相关系数分析。组间比较采取Kruskal-Wallis H检验法进行方差分析。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。

结 果

大鼠腹膜电荷特性对照组、尿毒症组、PD组及肝素组腹膜Cpam/Csam分别结果为1.91±0.89、2.32±0.74、3.11±0.76和2.24±0.59，尿毒症组与PD组及对照组比较差异有统计学意义(P分别为0.009和0.003)，但尿毒症组和PD组间无统计学意义。肝素组的Cpam/Csam显著低于PD组 (P=0.008)，但和对照组、尿毒症组相比无明显差异(图1)。

图1 各组大鼠腹膜电荷屏障比较

PD对白蛋白、SCr、BUN的清除情况对照组、尿毒症组、PD组及肝素组PD液白蛋白质丢失量分别为27.1±5.66 mg、41.3±8.34 mg、49.2±3.61 mg及39.9±3.73 mg。其中尿毒症组、PD组PD液白蛋白量显著高于对照组(P=0.0003，P=0.0002及P=0.0002)；同时PD组还高于尿毒症组(P=0.04)，肝素组与PD组相比，PD液白蛋白丢失量显著降低(P=0.001)，均有统计学差别。另外，尿毒症组、PD组以及肝素组SCr及BUN水平高于对照组，血清白蛋白均显著低于对照组；同时PD组SCr以及BUN还显著低于尿毒症组，有统计学差别(表1)。

腹膜电荷屏障与PD液白蛋白量的相关性我们对所有大鼠腹膜电荷屏障与PD液白蛋白量进行Spearman相关系数分析，结果显示两者显著负相关(r=-0.469,P=0.002)。

表1 不同组别PD液白蛋白丢失量、SCr和BUN水平比较a

表2 腹膜电荷屏障与PD液白蛋白量的相关性

讨 论

腹膜具有分子屏障及电荷屏障[2]，当负电荷屏障受损后，则携带负电荷的白蛋白等物就可通过这些半透膜，造成蛋白质丢失，从而影响血清白蛋白水平。目前检测电荷屏障的方法有染色法、免疫组织化学法、生物化学测定法、同位素法及清除法。除清除法适用于活体研究外，其他方法因繁琐而不适用于临床，也不能精确定量电荷屏障的改变程度。清除法目前主要采用内生蛋白为示踪物，如体内两种淀粉酶同工酶，胰淀粉酶(Pam)和唾液淀粉酶(Sam)。Pam与Sam 分子半径均为2.9 nm，相对分子质量均为56 000。两者等电点不同，Pam为7.0，Sam为5.9～6.4[8]。其原理是利用血中两分子半径相同，因受电荷屏障的作用，带负电荷较多分子的清除率将比带负电荷少的多，利用此原理，测定两种物质清除率比值即Cpam/Csam，即可在活体反映肾小球电荷屏障(GCB)的状态，正常成人肾脏Cpam/Csam为3.2(2.1～6.1)。当电荷屏障损害时，两种分子的清除率比值将发生变化，比值越高则提示损害越严重[9,10]。

尿毒症是一种微炎症状态，PD是其主要的治疗方式之一，但PD液可能会影响腹膜血管内皮细胞糖蛋白合成，损害电荷屏障。因此本文观察透析液能否损伤腹膜电荷屏障，讨论的是PD液的不良反应。我们参考国内文献[6]，对假手术组和尿毒症组大鼠用生理盐水灌腹，对实验组及肝素组大鼠用1.5%透析液灌洗腹腔结果显示，尿毒症及PD两种状态下Cpam/Csam的比值均高于对照组，提示腹膜电荷屏障均受到损害，而PD组电荷屏障损害较尿毒症组更为显著。有学者报道持续性不卧床腹膜透析(CAPD)患者对大分子溶质的转运清除主要是分子选择性的，可能没有电荷屏障的作用[11]。然而，本研究中所有大鼠PD液Cpam/Csam比值和PD液白蛋白间存在显著的负相关，因此判断PD大鼠腹膜负电荷屏障被破坏，增加了白蛋白的漏出。

对于肝素能否改善腹膜电荷屏障，至今未见相关报道。本研究结果显示，大鼠PD液Cpam/Csam比值显著低于PD组，提示其可能通过补充腹膜的负电荷，改善其屏障功能，进而减少白蛋白经腹膜丢失，结果显示PD液中蛋白质丢失量显著减少。

综上所述，我们认为正常情况下腹膜具有电荷特性，尿毒症时腹膜电荷特性受损，可导致PD液蛋白的丢失，而PD会进一步增加蛋白质的丢失。补充肝素可显著改善腹膜电荷屏障，减少蛋白质的丢失量。但本研究未将大鼠处死再用前述其他方法来测定大鼠腹膜电荷屏障，我们将在今后的研究中采用不同方法进行检测，比较其优缺点。

1 俞国庆,陈建,庄永泽,等.持续非卧床腹膜透析与蛋白质营养不良的相关因素分析.临床肾脏病杂志,2008,8(5):221-222.

2 Lyepoldt JK,Henderson LW.Molecular change influences transperitoneal macromolecule transport.Kidney Int,1993,43(4):837-844.

3 俞国庆,文文,陈建,等.腹膜透析患者腹膜电荷屏障对透析液蛋白质丢失的影响.肾脏病与透析肾移植杂志,2008,17(4):335-338.

4 俞国庆,文文,陈祖医,等.尿毒症大鼠腹膜电荷屏障变化以及腹膜透析对其影响.中华肾脏病杂志,2008,24(11):847-849.

5 Kborana AA，Sahni A，Ahland OD，et al.Heparin inhibition of endothelial cell proliferation and organization is dependent on molecular weight.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2003,23(11):2110-2115.

6 袁江姿，钱家麒，方炜,等.尿毒症腹透对大鼠腹膜形态和功能的影响.上海交通大学学报(医学版),2007,27(10):1189-1192.

7 Schilte MN,Loureiro J,Keuning ED,et al.Long-term intervention with heparins in a rat model of peritoneal dialysis.Perit Dial Int,2009,29(1):26-35.

8 O’Donnell MD,FitzGerald O,McGeeney KF.Differential serum amylase determination by use of an inhibitor,and design of a routine procedure.Clin Chem,1977,23(3):560-566.

9 Fox JG,Quin JD,O'Reilly DS,et al.Assessment of glomerularcharge selectivity in man by differential clearance of isoamylases.Clin Sci (Lond),1993,84(4):449-454.

10 Thum CN，Oelbaum RS，Foo AY，et al.Renal isoamylase clearance as a measurement of altered renal charge selectivity in patients with diabetes mellitus.Ann Clin Biochem,1993,35(PT 5):449-453.

11 Buis B,Koomen GC,Imholz AL,et al.Effect of electric charge on the transperitoneal transport of plasma proteins during CAPD.Nephrol Dial Transplant,1996,11(6):1113-1120.