高羊茅抗逆基因工程研究进展

杨沛艳,何亚丽,吴燕民

(1.兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020； 2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081；3.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240)

高羊茅(Festucaarundinacea)，又称苇状羊茅，是禾本科(Graminea)羊茅属(Festuca)宽叶亚属(Subgen．Subulatae)早熟禾族多年生草本植物[1]。全世界羊茅属植物100多种[2]，天然分布于整个美洲(北至斯堪的纳维亚62° N)、北非、西亚和西伯利亚,后被引进北美、南美、澳大利亚、新西兰和南非及东非。我国有20多种野生高羊茅，主要分布于四川的凉山、绵阳，贵州的西部及西北部海拔2 200 m以上的地区，在云南以滇东北和滇西北分布较多,多生于中山灌木草丛和亚高山草地、路旁、林下,海拔3 000～3 800 m之处[3]。西北、东北、华北地区、新疆伊利也有大面积高羊茅分布，多生于河谷草甸、山地草甸及山地草原。甘肃的高羊茅主要分布于甘南、临夏、祁连山一带,以海拔2 700～3 500 m的亚高山草甸、山坡、河谷、沙地为主。作为一种冷季型草坪草，高羊茅建坪成本低，建坪快，并且根系发达、色泽翠绿、绿期相对较长。目前,北京、上海、浙江、山东、江西、武汉、江苏等地将高羊茅广泛用于城市绿地规划和球场建设。在美国，高羊茅应用也非常广泛，年种植面积在1.87亿～14.07亿 hm2[4]。在抗逆方面，高羊茅具有较强的耐高温、耐寒冷及抗病能力，是一种有潜力的草坪草。近十多年来高羊茅在我国草坪中的应用迅速增加。为此，就高羊茅近几十年的发展作以综述，并对其发展趋势进行展望。

1 高羊茅抗逆基因工程再生体系的建立

通过高羊茅外植体诱导获得愈伤组织并产生再生植株在国内外已有不少研究[5-11]，研究者还对各种诱导激素浓度进行了优化，最高诱导率在80%以上，但免不了白化苗的产生(表1)。相比之下，由悬浮细胞培养物获得再生植株能降低白化苗的产生，但此法费时费力。基因型差异也是影响诱导率及植株再生很重要的一个因素。高羊茅组织培养始于20世纪70年代，Philip[12]首先以高羊茅的分生组织为外植体，培育出高羊茅小植株。钱海丰和薛庆中[5]研究发现不同培养基对高羊茅成熟胚诱导出愈率差别不大，相反，不同浓度2,4-D对出愈率影响比较显著，并发现最适宜的2,4-D浓度为9 mg·L-1，出愈率达66.7%。余建明等[6]研究发现，2,4-D浓度为1.0 mg·L-1、6-BA浓度为0.5 mg·L-1时“家园”高羊茅愈伤组织诱导率最大。江巨鳌等[7]、李晓辉等[8]在余建明等[6]研究的基础上对不同的激素浓度进行探索，发现2,4-D浓度为9 mg·L-1，6-BA浓度为2.0 mg·L-1时，诱导率最高，由之前的66.7%提高至70%。余桂红等[9]在确立高羊茅适宜的最佳培养基及最适宜的激素浓度外，发现3.0 g·L-1Gelrite相比琼脂更能提高愈伤组织诱导率及加快愈伤组织的生长，最高愈伤组织分化高达72.8%。王铖等[13]研究发现高羊茅种子分化培养基以MS+4 mg·L-12,4-D+0.2 KT最佳。梁蕊芳等[10]研究发现从一端切的高羊茅种子下胚轴较从两端切具有相对高的诱导率，加入适宜浓度(9 mg·L-1)的2,4-D时，愈伤组织诱导率高达80.7%。李志亮等[14]在前人研究的基础上确立了高羊茅种子灭菌的最佳方式，使种子萌发率提高至80%，从而提高了愈伤诱导率。高羊茅种子的消毒程序以次氯酸钠加无菌水搅拌去皮最佳[15]。王健等[11]的研究进一步证实了愈伤组织诱导培养基2,4-D的最佳浓度为9 mg·L-1，并确立了1/2 MS+NAA 0.5 mg·L-1为最佳生根培养基，生根率达100%。研究表明，成熟种子进行纵切后得到的半粒种子较完整种子具有更高的诱导率[16]。国内外由胚性悬浮培养物获得再生植株的例子也很多。Dalton[17]由高羊茅胚性悬浮培养物获得再生植株。Zaghmout和Torello[18]由紫羊茅(F.rubra)胚性悬浮培养物获得再生植株。Kasperbauer等[19]直接用高羊茅花药进行培养，将幼穗接种在含2.0 mg·L-12,4-D的诱导培养基上，7周后获得一批绿色小植株。Rose等[20]在草地羊茅(F.pratensis)上也获得了花药单倍体植株。

2 遗传转化

高羊茅的遗传转化开始于20世纪90年代初，转化方法各不相同[21-27](表2)。其中基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制，其最早在美国提出[28]，于1995年通过此方法获得转基因高羊茅植株[29]。梁蕊芳[21]在我国首次用此方法获得含有AtNHX1基因和CBF3基因的转基因耐盐高羊茅株系。原生质体转化法具有易选择转化体、避免产生嵌合体等优点。Ha等[22]于1992年首次通过此方法获得含有gusA基因和hph基因的转基因高羊茅植株。Kuai和Morris[23]用同样的方法获得含bar基因的可育抗性转基因高羊茅苗。Dalton等[24]利用硅碳纤维介导转化法成功将外源基因整合到高羊茅基因组中并得到表达。农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。Dalton等[24]通过此方法将hph基因和gusA基因成功导入高羊茅植株中。吴关庭[25]采用根癌农杆菌介导法获得含有CBF基因的耐盐转基因高羊茅植株，并发现其耐逆性得到增强。赵军胜等[26]以4个高羊茅品种为受体，获得含AtNHX1基因和nptⅡ基因的绿色抗性转基因植株。同年，Hu等[27]通过此方法转化高羊茅胚性悬浮细胞，建立了一整套稳定、高效的高羊茅转化体系。但农杆菌介导的遗传转化方法缺点是受基因型的限制。在有关高羊茅的遗传转化研究中，转化体大多采用潮霉素筛选，其次是用除草剂膦丝菌素。另外，确定最小的选择压力及最适宜的选择时期是转化成功的关键。

表2 高羊茅遗传转化方法进展Table 2 Genetic transformation of tall fescue

3 抗逆基因工程及生理研究

干旱与盐害等非生物胁迫严重影响植物的生长发育，长期胁迫会造成植物生长缓慢至死亡。

高羊茅是目前我国使用量增长最快的草种，夏季的高温环境及较大的需水量已成为限制其生长的主要因素，加之我国土壤盐渍化日益严峻。因此，提高对环境的适应性是目前高羊茅育种的主要目标之一。高羊茅遗传背景比较复杂，基因组较大，所以，和传统育种相比，将抗逆相关优良基因通过基因工程技术导入传统高羊茅品种中，从而增强高羊茅抗逆性显得尤为重要。

有相关研究表明，磷脂酰肌醇信号途径(Phosphatidylinositol Pathway)在植物对抗旱耐盐、高温等胁迫应答过程中起重要作用，而磷脂酰肌醇合成酶(Phosphatidylinositol Synthase，PIS)以CDP-DG和myo-inositol为底物生成磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，Ptdlns)。徐国荣[30]从玉米(Zeamays)中克隆出ZmPIS基因并导入高羊茅品种，对转基因植株进行耐旱耐盐性分析，发现转基因植株有较强的抗逆性。 Zhao等[31]从拟南芥(Arabidopsisthaliana)中克隆出Na+/H+逆向转运蛋白基因ANHXI，构建含有35S启动子的Na+/H+逆向转运蛋白基因遗传转化高效表达载体，转化高羊茅下胚轴，经分析，植株耐盐性明显提高。Tang等[32]从高羊茅中分离出FaDREBI基因，对其进行生物信息学分析，并通过荧光定量PCR分析其低温处理下根、茎、叶的表达量，发现其在低温处理下叶中表达量较高，从而参与植株对低温环境的响应。Cao等[33]将从拟南芥中分离的耐盐相关基因AtHDGII,通过农杆菌介导法转入高羊茅下胚轴，发现高羊茅在干旱及盐胁迫下，其生长发育无明显变化，但根部丙二醛含量下降，Na+/K+交换无明显变化，脯氨酸、过氧化氢酶活性增强，超氧化物歧酶合成加速，从而使植物抗盐性提高。赵彤等[34]从高羊茅中克隆16S/trnA/23s片段，增加了酵母海藻糖耐旱相关基因tsp1,构建三价表达载体，转化高羊茅幼嫩叶片，经分析表明，发现其在叶绿体中有很好的表达，为提高高羊茅耐旱性奠定基础。李志亮[35]将从拟南芥中分离的AtNHXI基因转化高羊茅愈伤组织，发现转基因植株能加快细胞质中多余的Na+排进液泡来消除Na+的毒害，从而提高植株耐盐性。吴关庭等[36]将耐逆相关基因转化高羊茅胚性愈伤组织，分别对转基因植株和对照植株进行低温(-5 ℃)、高温(45 ℃)、干旱(25 ℃不保湿)及2% NaCl处理，发现转基因植株较对照植株有显著生长优势，其相对电导率较对照低30%。证明转基因植株耐逆性有所增强。张志飞[37]对14个受高温干旱胁迫的高羊茅品种进行综合分析，发现在高温干旱胁迫下，叶片蜡质含量与植物水分利用率呈正相关，并首次将蜡质相关基因导入3个高羊茅品种中，得到抗旱性增强的转基因植株。赵汝等[38]发现转DREB1A基因的高羊茅植株对铅离子富集与转运能力要强于对照。Dong等[39]通过分析高羊茅对叶斑病(Cercosporafestuca)和褐斑病(C.viticala)的感病机理，转入AGLUI和青蛙表皮的SI基因，均能使高羊茅的抗病性得到增强。马生健等[40]通过基因枪法将含有抗真菌病的几丁质酶基因Chi和B-1，3-葡聚糖酶基因Glu双价表达载体转入高羊茅愈伤组织，转化株表现出较好的抗禾谷镰刀菌病的能力。高羊茅虫害危害较病害轻，目前转入的抗虫基因主要为Bt基因。在草坪杂草防除方面，草丁膦作为一种光谱性除草剂在国内外使用非常广泛，但其对草坪的毒害作用亦不能忽视，Bar基因可以使草丁膦的自由氨基乙酰化，减轻对植物的毒害，国内外许多学者通过转基因技术，获得含Bar基因的转基因高羊茅已不在少数。

4 存在问题及建议

我国是草坪草资源较丰富的国家之一，近几年国内外专家在高羊茅再生、基因工程、抗逆性方面的研究也越来越多，目前已获得大量抗逆性增强的转基因植株，为我国增添新的草种资源奠定了基础。但存在一些问题：1)高羊茅体系再生研究仍不够健全。出愈率不高，外植体仅仅局限于幼胚、幼穗、花药等，再生率不稳定，在组培方面对外源激素的作用机理及激素之间的相互作用尚不清楚，在外源激素的使用上太过盲目。2)高羊茅抗逆性的分子机制研究较少。3)高羊茅抗逆性的研究仅局限于对一些优良基因的转入，对转基因后代抗逆性研究较少。 4)在基因工程方面，缺乏一些新思路。针对这些问题，提出几点建议：1)在高羊茅愈伤再生方面，可通过确定分化的最有利时期来提高培养材料的分化率，提高愈伤组织再生率。在外植体的选择上，除幼胚、幼穗外，可通过切胚乳来提高出愈率，还可以以根尖分生区为外植体获得再生，且今后应在内源激素和外源激素的相互作用方面深入研究，通过测定内源激素的种类及水平来直接指导外源激素的添加。2)在植物对逆境的响应方面，应了解植物对逆境的适应、伤害、修复、补偿的自我调节过程，从分子水平上研究高羊茅抗逆性的生理功能及物质基础，通过基因手段进行改造，并结合育种手段培育抗逆性更全面的新品种。3)在获得转基因植株的基础上，分析不同世代植株的表达情况。4)在传统育种的基础上，结合现代育种新思路，比如，多基因聚合育种、同效多基因育种、多态单基因育种、多细胞聚合育种、染色体加和育种，培育优良草坪品种。

[1] 李志亮,黄丛林,李征,等.草坪草——高羊茅遗传育种研究进展[J].生物技术通报，2004，10(2):19-22.

[2] 李惠英,娄燕宏,胡涛,等.中国高羊茅种质资源遗传多样性的RAPD分析[J].草业学报,2010,18(12)：208-214.

[3] 彭燕,张新全,周寿荣.我国主要草坪草种质资源研究进展[J].园艺学报，2005,32(1):359-364.

[4] 黄新，叶红霞，舒小丽,等.生物技术在高羊茅育种研究中的应用[J].核农学报,2008,22(6):806-810.

[5] 钱海丰,薛庆中.激素对高羊茅愈伤组织诱导及分化的影响[J].中国草地,2002,10(1)：46-49.

[6] 余建明，张宝龙，陈志一,等.草坪型高羊茅成熟种子离体培养植株再生技术研究[A].全国作物细胞工程与分子技术育种学术研究论文集[C].苏州：全国作物细胞工程与分子技术育种研讨会，2003.

[7] 江巨鳌，赵运耕，陈志勇,等.高羊茅愈伤组织再生系统的建立[J].湖南农业大学学报，2003,29(5):385-387.

[8] 李晓辉,何亚丽,潘俊松,等.高羊茅的组织培养与植株再生[J].上海交通大学学报(农业科学版),2005,23(3):244-248.

[9] 余桂红,马鸿翔,佘建明,等.草坪型高羊茅成熟种子胚性愈伤组织诱导及植株再生[J].江苏农业学报,2004,20(1):38-43.

[10] 梁蕊芳，黄丛林，于荣,等.高羊茅植株再生体系的研究与建立[J].生物技术通报,2005,12(2):23-24.

[11] 王健,徐子勤,张永彦,等.高羊茅高频再生体系的建立[J].西北大学学报,2007,37(2):257-260.

[12] Philip J D.Meristem tip culture inLolium,Festuca,PhleumandDactylis[J].Plant Science Letters,1977,9(4)：333-338.

[13] 王铖，李青，辛燕.高羊茅种子愈伤组织诱导及植株再生研究[J].北京林业大学学报,2004,26(1):66-69.

[14] 李志亮,叶嘉，杨杰,等.高羊茅组培再生体系建立的研究[J].邯郸学院学报,2006,16(3):60-63.

[15] 王维飞,韩烈保,曾会明.高羊茅愈伤组织诱导及植株再生的研究[J].草业科学,2006,23(6):99-103.

[16] 闫军辉,赵智燕,何亚丽.两个高羊茅品种成熟种子再生体系的建立[J].草业学报,2011,22(2):210-218.

[17] Dalton S J.Plant regeneration from gell suspension protoplasts ofFestucaarundinaceaSchreb.,LoliumperenneL.andL.multiflorumLam[J].Journal of Plant Biotechnology,1988,12(2)：137-140.

[18] Zaghmout O M F,Torello W A.Somatic embryogenesis and plant regeneration from suspension cultures of red fescue[J].Crop Science,1988,29(2)：815-817.

[19] Kasperbauer M J,Buckner R C,Springer W D.Haploid plants by anther-panicle culture of tall fescue[J].Crop Science,1980,20(1)：103-107.

[20] Rose J B,Dunwell J M,Sunderland N.Anther culture ofLoliumtemulentum,FestucapratensisandLolium×FestucaHybrids.I.Influence of pretreatment,culture medium and culture incubation conditions on callus production and differentiation[J].Annals of Botany,1987,60(2)：191-201.

[21] 梁蕊芳.利用基因枪轰击法将NHX1、CBF耐逆相关基因导入高羊茅(Festucaarundinacea)[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2005.

[22] Ha S B,Wu F S,Thorne T K.Transgenic turf-type tall fescue plants regenerated from protoplasts[J].Plant Cell Reports,1992,11(12):601-604.

[23] Kuai B,Morris P.The physiological state of suspension cultured cells affects the expression of the β-glucuronidase gene following transformation of tall fescue (Festucaarundinacea) protoplasts[J].Plant Science,1995,110(2)：235-247.

[24] Dalton S J,Benttany A J E,Timms E.Transgenic plants ofLoliummultiflorum,Loliumperenne,FestucaarundinaceaandAgrostisstoloniferaby silicon carbide fibre-mediated transformation of cell suspension cultures[J].Plant Science,1998,132(1):31-43.

[25] 吴关庭.农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立及CBF耐逆相关基因的导入[D].杭州:浙江大学,2004.

[26] 赵军胜,支大英,薛哲勇,等.根癌农杆菌介导的高羊茅遗传转化研究[J].遗传学报,2005,32(6):579-585.

[27] Hu Z H,Chen J Q,Wu G T,etal.Highly efficient transformation and plant regeneration of tall fescue mediated byAgrobacteriumtumefaciens[J].Journal of Plant Physiology and Molecular Biology,2005,31(2):149-159.

[28] Primrose S B,Twyman R,Old B.基因操作原理[M].瞿礼嘉,顾红雅,译.北京:高等教育出版社,2003：28-33.

[29] Spangenberg G,Wang Z Y,Wu X L,etal.Transgenic tall fescue (Festucaarundinacea) and red fescue (F.rubra) plants from microprojectile bombardment of embryogenic suspension cells[J].Plant Physiology,1995,145(5-6):693-701.

[30] 徐国荣.转ZmPIS基因提高高羊茅耐旱耐盐性研究[D].济南：山东大学，2008.

[31] Zhao J S,Zhi D Y,Xue Z Y,etal.Enhanced salt tolerance of transgenic progeny of tall fescue expressing avacuolar Na+/H+antiporter gene fromArabidopsis[J].Journal of Plant Physiology,2007,164(12):1377-1383.

[32] Tang M J,Lü S Y,Jing Y X,etal.Isolation and identification of a cold-inducible gene encoding a putative DRE-binding transcription factor fromFestucaarundinacea[J].Plant Physiology and Biochemistry,2005,43(23)：233-239.

[33] Cao Y J,Wei Q,Liao Y,etal.Ectopic overexpression ofAtHDG11 in tall fescue resulted in enhanced tolerance to drought and salt stress[J].Plant Cell Reports,2009,28(4):579-588.

[34] 赵彤，于荣，黄丛林.高羊茅叶绿体表达载体构建及绿色荧光蛋白基因瞬时表达检测[J].中国农业科学,2009,42(3):1116-1122.

[35] 李志亮.高羊茅抗渗透胁迫基因工程改良的研究[D].石家庄：河北师范大学，2004.

[36] 吴关庭，陈锦清，胡张华,等.根癌农杆菌介导转化获得耐逆性增强的高羊茅转基因植株[J].中国农业科学，2005,38(12):2395-2402.

[37] 张志飞.抗旱高羊茅品种FapDREB2基因克隆和WAX2基因的遗传转化[D].长沙：湖南农业大学，2007.

[38] 赵汝,韩烈保,曾会明.铅胁迫下转DREB1A高羊茅对铅的吸收与耐受性研究[J].中国草地学报，2010,32(2):54-60.

[39] Dong S,Tredway L P,Shew H D,etal.Resistance of transgenic tall fescue to two major fungal diseases[J].Plant Science,2007,173(12)：501-509.

[40] 马生健,曾富华，徐碧玉，等.基因枪介导的高羊茅基因转化体系的建立[J].园艺学报，2004，31(5):691-693.