高效免疫调节剂对S180肉瘤小鼠IL-6及IL-10表达的调节作用

常欣峰,宋春花,罗宝英,罗亚楠,李 欢,黄志华,韩立民*

(1.湖南中医药大学，长沙 410007；2.赣南医学院，江西 赣州 341000)

肿瘤的发生、发展和转移与机体的免疫状态密切相关。研究[1-2]表明，肿瘤患者都会出现不同程度的免疫功能下降现象,如NKC活性、CD4+/CD8+比值、IL-2含量等均呈下降趋势，这是肿瘤得以无限增长的一个重要因素。而肿瘤的生长又通过分泌免疫抑制因子进一步抑制宿主免疫功能，从而形成恶性循环[3]。近年来,肿瘤的生物治疗得到长足的发展，在改善患者生存质量，降低复发率方面的重要作用已得到越来越多的认可和重视。肿瘤的生物治疗成为继手术、放疗、化疗之后的第四大治疗方法。目前国内外有关肿瘤生物治疗包括：免疫调节剂治疗、肿瘤细胞瘤苗治疗、过继性T细胞治疗-CIK、树突细胞疫苗治疗和造血干细胞移植治疗等五大方法。笔者通过对已上市疫苗进行的筛选研究，确定了多价疫苗应用的处方(HIS)，并申请了中国发明专利(申请号：200810107096.6)。在前期工作中，已完成对HIS急性和3个月长期毒性实验的观察。本次实验以S180肉瘤小鼠为模型，通过计算脾指数、抑瘤率及检测IL-6、IL-10，初步探讨HIS对免疫系统的影响及抑瘤机理。

1 材料

1.1 动物及瘤株 SPF级昆明小鼠40只，雄性，6～8周龄，体质量18～22 g,由湖南省斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2009-0004，合格证号,4300016645。S180瘤株，由中国医学科学院医药研究所购进，赣南医学院科研中心传代培养。

1.2 药品及试剂 高效免疫调节剂(HIS)，由江中肿瘤治疗研究组提供，批号：110325;环磷酰胺，白色粉状针剂，0.2 g/支，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号：12041125；IL-6放免检测试剂盒购自北京普尔伟业生物科技有限公司，批号：20120820;IL-10多克隆抗体购自博士德生物工程有限公司(货号:BA1201)；BCA蛋白定量试剂盒购自天根生化科技有限公司(货号：A：Lot#J9122；B：Lot#J8830)。

1.3 仪器 SN-695型智能放免γ测量仪(上海核福光电仪器有限公司),赛多利斯BS224S型电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)，MK3型酶标仪(美国Thermo公司)。垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)，化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 S180肉瘤小鼠模型的建立 于超净工作台，无菌条件下抽取接种S180瘤株7 d的小鼠腹水，呈淡奶白色，生理盐水稀释后,1 000 r/min，离心5 min，弃上清液，用生理盐水将细胞重悬，苔盼蓝染色，肿瘤活细胞比率>95%，调整细胞浓度为1×107个/mL，置于冰水中保存。75%乙醇消毒,0.2 mL/只接种于小鼠右腋部皮下，正常对照组接种同体积的生理盐水。

2.2 分组及给药 接种后次日，将40只小鼠随机分为4组,即正常对照组、S180肉瘤模型组、S180肉瘤模型加环磷酰胺组(CTX组)、S180肉瘤模型加高效免疫调节剂组(HIS组)，每组10只。CTX组于小鼠腹腔注射CTX，50 mg/kg；HIS治疗组给予腹股沟皮下注射浓度为0.03 g/mL的HIS 0.1 mL/10 g体质量,终剂量为0.3 g/kg；正常对照组及S180肉瘤模型组腹腔注射等容积生理盐水。以上各组均3 d给药1次。连续10 d(即给予4次药物治疗)。

2.3 瘤重、抑瘤率及脾指数测定 于末次给药24 h后，称体质量，取血，取脾脏、肿瘤，电子天平称脾脏及肿瘤质量。

2.4 放射免疫学方法检测血清IL-6水平 摘眼球取血置于促凝管中，4 ℃、3 000 r/min，离心10 min，制备血清，-80 ℃保存。送往北京普尔伟业生物科技有限公司代检。

2.5 Western blot法检测肿瘤组织细胞因子IL-10表达 于-80 ℃冰箱中称取肿瘤组织20～30 mg，以预冷的PBS清洗并用眼科剪将组织剪碎于1.5 mL EP管中，再加入适量的蛋白裂解液研磨，4 ℃颠倒混匀1 h，12 000 r/min，离心5 min，抽取上清液，即为组织总蛋白，用BCA蛋白检测法进行蛋白定量。取50 μg蛋白，调整体积为24 μL，样品煮沸5 min，6 000 r/min，离心5 min，经SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法将蛋白转移至NC膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，1∶200稀释的IL-10一抗,4 ℃孵育过夜；TBST洗3次，每次5 min；1∶1 000稀释的二抗，室温孵育l h，TBST洗3次，每次10 min；用ECL发光剂室温孵育l min，化学发光成像系统照相，体积法测定各条带的光密度值。同样方法测定β-actin的光密度值,各条带IL-10与相应β-actin的光密度值比值为该条带的相对光密度值。各组取3只小鼠的样本，重复试验3次,每次以模型组条带相对光密度值为1进行数据标准化，所得9次数据进行统计学分析。

3 结果

3.1 HIS对S180肉瘤小鼠瘤重、抑瘤率及脾指数的影响 见表1。

表1 HIS对S180肉瘤小鼠瘤重、抑瘤率及脾指数的影响(±s,n=10)

3.2 HIS对S180肉瘤小鼠血清IL-6水平的影响 见图1。

注：与正常对照组比较，##P<0.01；与肿瘤模型组比较，△△P<0.01；与CTX组比较，▲▲P<0.01。

3.3 HIS对S180肉瘤小鼠肿瘤组织细胞因子IL-10表达的影响 见图2。

注：与肿瘤模型组比较，##P<0.01；与CTX组比较，△△P<0.01。

4 讨论

本实验结果表明,HIS可明显抑制S180肉瘤的生长，同时小鼠的脾指数升高，提示HIS可通过提高机体的免疫功能起到抗肿瘤作用。

免疫机制的失能是肿瘤形成的重要因素。其中Th1/Th2细胞的平衡向Th2细胞漂移是肿瘤免疫机制失能的主要表现之一。Thl类细胞分泌IL-2、INF-γ和TNF-β等细胞因子，是机体抗癌、抗病毒的主要参与者；Th2类细胞分泌IL-4、IL-6和IL-l0等细胞因子,在体内可抑制免疫应答[4]。而肿瘤宿主处于Th2细胞因子优势状态是肿瘤免疫逃逸的机理之一。IL-6是一种多效应的细胞因子，也是重要的免疫抑制因子[5]，主要由淋巴细胞、激活的巨噬细胞和血管内皮细胞产生。IL-6与多种肿瘤发生、发展关系密切,它通过干预细胞的黏附性、血栓形成、肿瘤特异性抗原的表达及肿瘤细胞的增值从而影响肿瘤的进展[6]。IL-10作为重要的免疫抗炎因子,也被称为人类细胞因子合成抑制因子。它能抑制T细胞的增殖分化，抑制单核细胞和自然杀伤细胞的生物活性，抑制Th1细胞产生IL-2、INF-γ等,从而下调机体的抗肿瘤反应[7-9]。实验结果表明，HIS可明显降低小鼠外周血IL-6水平，降低肿瘤组织中IL-10表达。提示HIS可抑制肿瘤形成过程中Th1/Th2细胞的平衡向Th2细胞漂移，减轻肿瘤机体的免疫机制的失能，从而有效抑制肿瘤的生长。

综上所述，HIS可提高机体免疫功能并有抑瘤效果。作用机理可能与HIS降低了免疫抑制因子IL-6、IL-10表达水平，抑制Th1/Th2细胞平衡向Th2细胞漂移有关。从而为进一步在临床推广和使用HIS提供了理论依据。

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