接合物蛋白在甲状腺乳头状微小癌中的表达及其临床意义

杨香山，程绍梅，郭京艳，李成军，李爱萍，韩 琳

近年来，甲状腺乳头状微小癌的发病率逐渐增高且发病机制及术式选择日渐受到关注。甲状腺乳头状微小癌的发生与多种因素有关，如环境因素、癌基因等。接合物蛋白(CRKL)作为CRK(CT10 regulator of kinase)家族的成员之一，通过SH2结构域和SH3结构域与多种信号分子结合形成复合物，将信号传递给下游，通过多条信号途径参与肿瘤发生发展[1]。然而，CRKL在甲状腺乳头状微小癌中的表达国内外报道较少，本研究采用免疫组织化学(SP)技术检测甲状腺乳头状癌、甲状腺乳头状微小癌、结节性甲状腺肿及正常甲状腺组织中CRKL的表达，通过对比CRKL的表达差异，探讨CRKL在甲状腺乳头状微小癌中的临床意义。

1　资料与方法

1.1临床资料收集山东省医学科学院附属医院2008—2013年经手术治疗的50例直径>1 cm的甲状腺乳头状癌患者、50例甲状腺乳头状微小癌患者、50例结节性甲状腺肿患者、50例正常者甲状腺组织的石蜡标本。甲状腺乳头状癌组：男13例，女37例；年龄16～76岁，中位年龄44岁，其中≤45岁31例，>45岁19例；有颈淋巴结转移36例，无颈淋巴结转移14例；均行手术并经病理证实；术前均无化疗、放疗及免疫治疗史。甲状腺乳头状微小癌组：男6例，女44例，年龄22～68岁，中位年龄45岁，其中≤45岁22例，>45岁28例；有颈淋巴结转移27例(伴甲状腺被膜浸润8例)，无颈淋巴结转移23例(均无甲状腺被膜浸润)；均行手术并经病理证实；术前均未行其他治疗。结节性甲状腺肿组：男15例，女35例，年龄19～68岁，中位年龄42岁；单发20例，多发30例；均行手术并经病理证实，术前均未合并其他疾病。正常甲状腺组织组：男9例，女41例；年龄21～66岁，中位年龄42岁；均随机选自甲状腺乳头状癌以及甲状腺乳头状微小癌患者的癌旁正常组织，均经山东省医学科学院附属医院病理科两名医生确诊为正常组织；术前均未合并其他疾病。

1.2主要试剂小鼠抗人CRKL单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗、多聚物辅助试剂与二氨基联苯胺(DAB)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3SP染色方法以Santa Cruz公司提供的CRKL表达阳性的切片作为阳性对照，磷酸盐(PBS)缓冲液作为阴性对照。石蜡标本常规切片、脱蜡、水化、过氧化氢(H2O2)去除组织过氧化物酶，抗原修复15 min；PBS冲洗5 min/次，共3次，加入山羊血清封闭20 min，加入小鼠抗人CRKL 4 ℃过夜；PBS冲洗，加入多聚物辅助试剂孵育15 min；PBS冲洗，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗孵育20 min；DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片，在光学显微镜下观察染色情况。阳性表达时细胞质呈棕黄色片状或颗粒状，根据阳性细胞分布情况，每张切片选取5个不同的视野，采用Image Pro Plus图像分析系统计算CRKL表达平均吸光度(MOD)。

1.4Western blotting实验按常规方法提取组织总蛋白，BCA蛋白定量后，每道加入50 μg蛋白，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉TBST溶液封闭后加入CRKL兔抗人抗体(1∶500)，4 ℃过夜。TBST溶液洗膜，GAPDH作为内参，加入辣根过氧化物酶结合的二抗。ECL化学发光试剂盒检测。Quantity one分析蛋白条带灰度值。以目的条带灰度值与对应的GAPDH灰度值之比作为蛋白水平的定量指标。

2　结果

2.1CRKL在不同甲状腺组织中的表达情况CRKL在甲状腺乳头状癌和甲状腺乳头状微小癌细胞的胞膜与胞质阳性表达，呈浅黄色-棕褐色细颗粒状(见图1、2)；CRKL在结节性甲状腺肿的部分细胞中表达，呈浅黄色-棕褐色细颗粒状(见图3)；正常甲状腺组织细胞几乎未见染色(见图4)。

甲状腺乳头状癌组、甲状腺乳头状微小癌组、结节性甲状腺肿组及正常甲状腺组织组中CRKL的表达阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中甲状腺乳头状癌组、甲状腺乳头状微小癌组高于结节性甲状腺肿组和正常甲状腺组织组，差异均有统计学意义(P<0.05)。4组中CRKL表达的MOD比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中甲状腺乳头状癌组、甲状腺乳头状微小癌组高于结节性甲状腺肿组和正常甲状腺组织组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2CRKL表达量与甲状腺乳头状癌、甲状腺乳头状微小癌临床病理特征的关系CRKL表达量与甲状腺乳头状癌和甲状腺乳头状微小癌患者年龄、性别、病灶数目均无关(P>0.05)；与有无侵犯被膜、有无颈淋巴结转移有关(P<0.05，见表2)。

表1　不同甲状腺组织中CRKL表达阳性率及表达量比较

注：▲为F值；与结节性甲状腺肿组比较，*P<0.05；与正常甲状腺组织组比较，△P<0.05；MOD=平均吸光度

Table2Correlation between expression of CRKL and clinical pathological data of patients with thyroid papillary or carcinoma thyroid papillary micro-carcinoma

甲状腺乳头状癌例数　　MOD　　　t值　P值甲状腺乳头状微小癌例数　　MOD　　　t值　P值性别1 52>0 051 89>0 05　男130 498±0 22160 501±0 281　女370 558±0 230440 543±0 221年龄(岁)0 89>0 051 68>0 05　<45310 523±0 192220 512±0 169　≥45190 562±0 215280 551±0 102病灶数目1 63>0 051 96>0 05　单发320 576±0 246240 533±0 157　多发180 521±0 198260 519±0 235侵犯被膜6 09<0 015 68<0 01　有110 679±0 12180 702±0 092　无390 495±0 104420 486±0 152颈淋巴结转移8 12<0 017 53<0 01　有360 739±0 118270 764±0 085　无140 286±0 098230 325±0 134

图1CRKL在甲状腺乳头状癌阳性表达 (SP，×200)

图2CRKL在甲状腺乳头状微小癌阳性表达 (SP，×200)

图3CRKL在结节性甲状腺肿阳性表达 (SP，×200)

图4CRKL在癌旁正常组织阴性表达 (SP，×200)

Figure1Positive expression of CRKL in thyroid papillary carcinoma

Figure2Positive expression of CRKL in thyroid papillary micro-carcinoma

Figure3Positive expression of CRKL in nodular goiter

Figure4Negative expression of CRKL in normal tissues adjacent to thyroid papillary carcinoma

2.3Western blotting实验检测CRKL在甲状腺乳头状癌与甲状腺乳头状微小癌组织的表达甲状腺乳头状癌组与甲状腺乳头状微小癌组CRKL含量均高于正常甲状腺组织组；甲状腺乳头状癌和甲状腺乳头状微小癌转移组的CRKL含量均高于未转移组(见图5、6)。

图5CRKL在正常甲状腺组织及甲状腺乳头状癌未转移组、转移组中的表达情况

Figure5Expression of CRKL in tissues adjacent to thyroid papillary carcinoma,carcinoma tissues without metastasis and carcinoma tissues with metastasis

图6CRKL在正常甲状腺组织及甲状腺乳头状微小癌未转移组、转移组中的表达情况

Figure6Expression of CRKL in tissues adjacent to thyroid papillary micro-carcinoma,carcinoma tissues without metastasis and carcinoma tissues with metastasis

3　讨论

甲状腺乳头状癌是头颈部最常见的内分泌腺恶性肿瘤，尽管生长相对缓慢，但极易发生早期颈淋巴结转移，部分患者在晚期发生远处转移，如转移到肺、骨和脑等，严重影响患者的生存。甲状腺乳头状微小癌是甲状腺乳头状癌的一种亚型，直径在1 cm以下，但仍具有腺内与腺外侵袭性及颈部淋巴结或远处转移的特性。

本研究结果显示，直径>1 cm的甲状腺乳头状癌及甲状腺乳头状微小癌组织中CRKL表达的MOD高于结节性甲状腺肿和正常甲状腺组织。已有研究表明，CRKL在乳腺癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤中呈过度表达[2-5]，且与患者预后、肿瘤恶化紧密相关,本研究与此相符。

CRKL是CRK家族成员之一，是整合素介导的信号途径的下游分子之一，其结构中含有一个SH2结构域和两个呈串联排列的SH3结构域。CRKL中SH2结构域与上游酪氨酸磷酸化的Cas、CasL、HEFl、BCR/Cbl等信号分子结合，而N端的SH3结构域与下游富含脯氨酸的Dockl80、C3G、Sos、ABL和P13K等信号分子结合形成“黏着斑”复合物[5-7]，从而将信号通过Dockl 80传递给Racl，刺激细胞层状边缘和细胞膜波动缘的形成，可促进细胞运动、增殖及分化[8]。去磷酸化的CRKL可激活C3G[9]，C3G促进Rapl与GDP分离，使其与GTP结合，从而使Rapl无活性的GDP结合形式转变为有活性的GTP结合形式，再通过MAPK途径亦可促进细胞运动、增殖及分化。CRKL蛋白可能通过整合信号通路增加肿瘤细胞的运动和浸润，促进甲状腺乳头状癌细胞增殖、分化、迁移，进而影响甲状腺乳头状癌的发生发展。由此推测可以通过拮抗或沉默CRKL蛋白的表达及阻断其信号通路中的蛋白分子来阻止甲状腺乳头状癌的发生和发展。

本研究结果显示，CRKL在甲状腺乳头状微小癌和甲状腺乳头状癌中表达无差异，但CRKL表达与甲状腺乳头状微小癌和甲状腺乳头状癌的淋巴结转移、侵犯被膜均有关系，提示二者可能具有相同的生物学特性。甲状腺乳头状癌早期经淋巴结转移，而对于甲状腺乳头状癌的手术方式，国外学者建议应行预防性颈淋巴结清扫术[10]。由于甲状腺乳头状微小癌也经颈淋巴结转移，故在治疗方面二者可以采用相同的手术方式，对甲状腺乳头状微小癌也应行颈部淋巴结清扫。

总之，CRKL的表达可以作为潜在的靶点用于甲状腺乳头状癌、甲状腺乳头状微小癌等的治疗[11]；另外，CRKL与甲状腺乳头状癌、甲状腺乳头状微小癌颈淋巴结转移、被膜侵犯密切相关，更为临床颈淋巴结清扫奠定了理论基础。

1翟波，廖侃.接头蛋白c-Crk的结构和功能[J].生命的化学，2003，23(3)：198-201.

2Fathers KE,Rodrigues S,Zuo D,et al.CrkⅡ transgene induces atypical mammary gland development and tumorigenesis[J].Am J Pathol,2010,176(1):446-460.

3沈太敏，赵纯全，赵涌，等.接合物蛋白Crk和CrkL在上皮性卵巢癌中的表达及意义[J].中国全科医学，2008，11(6)：940-942.

4Cheung HW,Du J,Boehm JS,et al.Amplification of CRKL induces transformation and epidermal growth factor receptor inhibitor resistance in human non-small cell lung cancers[J].Cancer Discov,2011,1(7):608-625.

5Janoštiak R,Tolde O,Bruhová Z,et al.Tyrosine phosphorylation within the SH3 domain regulates CAS subcellular localization,cell migration,and invasiveness[J].Mol Biol Cell,2011,22(22):4256-4267.

6Zheng J,Machida K,Antoku S,et al.Proteins that bind the Src homology 3 domain of CrkⅠ have distinct roles in Crk transformation[J].Oncogene,2010,29(48):6378-6389.

7Watanabe T,Tsuda M,Tanaka S,et al.Adaptor protein Crk induces Src-dependent activation of p38 MAPK in regulation of synovial sarcoma cell proliferation[J].Mol Cancer Res,2009,7(9):1582-1592.

8Wang H,Linghu H,Wang J,et al.The role of Crk/Dock180/Rac1 pathway in the malignant behavior of human ovarian cancer cell SKOV3[J].Tumour Biol,2010,31(1):59-67.

9Cheung HW,Du J,Boehm JS,et al.Amplification of CRKL induces transformation and epidermal growth factor receptor inhibitor resistance in human non-small cell lung cancers[J].Cancer Discov,2011,1(7):608-625.

10Chisholm EJ,Kulinskaya E,Tolley NS.Systematic review and meta-analysis of the adverse effects of thyroidectomy combined with central neck dissection as compared with thyroidectomy alone[J].Laryngoscope,2009,119(6):1135-1139.

11Natsume H,Shinmura K,Tao H,et al.The CRKL gene encoding an adaptor protein is amplified,overexpressed,and a possible therapeutic target in gastric cancer[J].J Transl Med,2012(10):97.