胎鼠神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经元特异性烯醇化酶和皮质体感诱发电位的影响研究

孔令胜，靳 峰，郭 强，张 浩，胡亚伟

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)对机体造成灾难性的后果，表现为损伤节段平面以下感觉、运动功能完全丧失和大小便失禁。由于缺乏有效的治疗方法，世界各国均把SCI的临床治疗作为一项难题及科研重点。神经干细胞(NSCs)具有自我增殖能力和多向分化潜能，在神经损伤修复方面有着良好的应用前景[1-3]，NSCs移植已成为治疗SCI新的研究热点[4-6]，但对移植后神经元特异性烯醇化酶(NSE)和皮质体感诱发电位(CSEP)的变化研究少。本研究旨在动态观察NSCs移植对大鼠SCI后NSE和CSEP的影响，从而为NSCs移植治疗SCI提供理论和物质基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 成年健康雄性清洁级SD大鼠40只，体质量(250±20)g(徐州医学院实验动物中心)；5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)抗体(Sigma)，基础细胞培养基(DMEM/F12，1∶1,Hyclone)，B27复合物(Gibco)，成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮样生长因子(EGF，Invitrogen)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，多聚赖氨酸(Sigma)，巢蛋白(Nestin)抗体(Sigma)，NSE抗体(Sigma)，二氨基联苯胺(DAB)液体(Boster)，二步法免疫组化试剂盒(Zymed)，其他试剂均为国产分析纯或化学纯。自行研制的电控SCI自动打击装置。NDI-200海神号神经电检诊仪(上海海军医学研究所)。

1.2 方法

1.2.1 胚胎大鼠NSCs的分离培养和鉴定以及移植细胞的制备分别参见参考文献[7]和[8]进行。

1.2.2 大鼠SCI模型的制作及分组 SD大鼠40只按随机数字表法分为Brdu+NSCs组、NSCs组、SCI组和假手术组(Sham组)，每组10只。Sham组仅做椎板切开术。SCI组：戊巴比妥钠溶液(0.5 ml/100 g)腹腔麻醉后，将大鼠固定于立体定位仪上，以第13肋为标志沿后正中线切开，咬除T13～L1椎板暴露脊髓，固定T12、L2椎体，以T13棘突相对应的脊髓后正中血管为中心用电磁程控铁棒下落打击装置损伤脊髓，打击力量为10×2.5 g·cm。NSCs组：神经干细胞植入损伤脊髓组。Brdu+NSCs组：Brdu标记的神经干细胞移植组。大鼠死亡及时复制模型补充。

1.2.3 脊髓内NSCs移植 造模成功后即刻参考Miura等[9]方法行NSCs移植。大鼠麻醉后固定于立体定位仪上，原切口进入，在平T13棘突处硬脊膜背侧正中血管旁1 mm处轻轻挑开硬脊膜成一纵行小口，用汉密尔顿微量注射器，向头侧呈45°角进针，深度1.5 mm，将细胞浓度为2×105/μl的NSCs悬液5 μl、0.9%氯化钠溶液5 μl分别注入NSCs组、SCI组，10 min内完成注射，保留5 min后退出。

1.2.4 CSEP检查 参照人类CSEP检测和记录的方法，在室温25 ℃的实验室中，大鼠腹腔麻醉，刺激电极置于内踝胫后神经上，阳极置远心端，小腿部皮下接地，记录电极置于颅表相当于人类的中央区(Cz)，参考电极置于前额区(FPz)，电极阻抗<5 kΩ，带通范围30～1 500 Hz，分析时间50 ms，刺激频率3 Hz，刺激强度为引起趾的轻微收缩，叠加500 次，每次检查至少重复2次，以求获得较好的重复性[10]。CSEP检测结束行组织病理学取材观察。

1.2.5 苏木素-伊红(HE)染色、Brdu及NSE免疫组织化学染色 NSCs移植后第1、3、7、14、28 天取材，大鼠在深麻醉下，以0.4%多聚甲醛行心脏灌流固定，取损伤段脊髓，在30%蔗糖磷酸盐缓冲液中沉底后，用冷冻切片机自SCI处做连续横切片，片厚30 μm，切片收集于装有0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液的细胞培养板的两孔中，依次留片，每孔中留片15张。行常规HE染色及按二步法免疫组织化学试剂盒操作步骤进行Brdu、NSE免疫化学染色。

1.2.6 图像分析 采用LEICA QWin图像处理与分析系统进行分析。在200倍镜下计数脊髓沿中央导水管横线以前NSE阳性细胞数；在400倍镜下选择不重叠的5个视野计算NSE阳性细胞灰度。

2 结果

2.1 皮质体感诱发电位-P波(CSEP-P)检测结果 Sham组大鼠在各时间点CSEP-P潜伏期为17～18 ms，经比较左右两下肢测量的结果差异无统计学意义(P>0.05)，统一选择右下肢的测量结果。4组间各时间点CSEP-P潜伏期比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。Sham组和SCI组各时间点间CSEP-P潜伏期比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；而Brdu+NSCs组和NSCs组各时间点间比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。其中SCI组、NSCs组和Brdu+NSCs组各时间点CSEP-P潜伏期与Sham组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；NSCs组和Brdu+NSCs组除第1天外余各时间点与SCI组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；Brdu+NSCs组与NSCs组比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。排除了Brdu对实验结果的影响。

2.2 移植NSCs在脊髓内的存活及迁移 Brdu阳性细胞呈时间依赖性变化趋势[8]：Brdu阳性细胞在移植术后第7天可检测到，为棕黄色核标记的小圆形细胞，沿移植穿刺针道呈串珠状排列，Brdu阳性细胞平均每高倍镜视野阳性细胞数为(7.3±1.7)个；第14天移植细胞在临近损伤区逐渐增多，阳性细胞数为(18.4±3.0)个(t=10.245，P<0.01)，且向移植针道周围迁移可达1.1 cm；移植术后第28天阳性细胞逐渐减少并消失，其余各组无阳性细胞。

2.3 脊髓HE染色的光镜观察 Sham组大鼠脊髓灰质运动神经元、胶质细胞的细胞轮廓清楚，胞核清晰，部分细胞可见核仁，呈鸟眼样。SCI组损伤后第1天，脊髓背侧可见缺损区域，灰质结构破坏，白质中可见有肿胀的轴突和大量的空泡。SCI后第3天及第7天灰质和白质中部分细胞形态改变，突起减少，胶质细胞增生。SCI后第14～28天，损伤范围更为明确，脊髓变细并有空洞形成，胶质细胞瘢痕形成。Brdu+NSCs组移植后第1天，脊髓中可见出血灶，灰质结构破坏，尼氏体减少，细胞体积减小；第3天及第7天损伤达高峰，残留细胞数量相对较多。SCI后第14天及第28天，损伤部位残留细胞形态大致正常，尼氏体增加。Brdu+NSCs组与NSCs组之间比较病理学改变无明显差异(见图1、2)。

2.4 NSE免疫组织化学染色结果分析 NSE主要存在于神经元的胞质中。4组间各时间点NSE 免疫阳性细胞灰度值及阳性细胞数比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。Sham组各时间点间NSE 免疫阳性细胞灰度值及阳性细胞数比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而SCI组、Brdu+NSCs组和NSCs组各时间点间比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。其中SCI组、NSCs组和Brdu+NSCs组各时间点NSE 免疫阳性细胞灰度值及阳性细胞数与Sham组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；NSCs组和Brdu+NSCs组除第1天外余各时间点与SCI组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；Brdu+NSCs组与NSCs组比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2、表3)。NSE免疫阳性细胞灰度值及阳性细胞数与CSEP-P潜伏期均呈负相关(r=-0.937，P<0.001；r=-0.956，P<0.001)。

表1 4组各时间点CSEP-P潜伏期比较Table 1 Comparison of the latency of CSEP-P wave at each time point in four groups

注：与Sham组比较，▲P<0.01；与SCI组比较，*P<0.01

图1 SCI组移植后第7天(A)与移植后第28天(B)的HE染色(A：×100，B：×40)Figure 1 HE staining 7 d(A) and 28 d(B)after transplantation in SCI group

表2 4组各时间点NSE 免疫阳性细胞灰度值比较Figure 2 Comparison of the grey level of NSE immunostaining positive cells at each time point in four groups

注：与Sham组比较，▲P<0.01；与SCI组比较，*P<0.01

表3 4组各时间点NSE免疫阳性细胞数比较Table 3 Comparison of NSE immunostaining positive cells at each time point in four groups

注：与Sham组比较，▲P<0.01；与SCI组比较，*P<0.01

3 讨论

中枢神经再生问题一直是神经科学界在理论研究和临床实践上感到十分困惑且尚未找到有效治疗方法的重大难题。因而外伤导致中枢神经的损害尤为严重，诸如脑皮质功能受损或消失、SCI所致的瘫痪等[11-13]。NSCs是中枢神经系统中保持分裂和分化潜能的细胞，NSCs移植已成为人们探索治疗神经系统损伤的新途径，有研究报道，NSCs移植能在挫伤脑组织存活、迁移，并促进宿主神经元存活、局部轴突再生和改善脑挫伤大鼠神经功能[14]。Brdu是胸腺苷类似物，可通过碱基互补配对的原则整合到处于S期的原始干细胞双链DNA中，在半保留复制过程中逐渐消减。本研究将Brdu标记的NSCs移植到大鼠SCI区，并于移植后第7天、第14天检测到逐渐增多的Brdu阳性细胞，移植细胞沿移植穿刺针道排列并发生了迁移，以上结果表明移植的NSCs可以存活于SCI区并向SCI区域发生了迁移，从而为下一步深入研究奠定了基础。

CSEP是连续刺激外周感觉神经纤维在中枢神经系统诱发的综合电位活动，其变化可反映出脊髓神经功能受损的程度，能够客观、量化和敏感地评价感觉功能障碍[15]。研究证实，脊髓后索和后外侧索是CSEP传导的主要通路。由于脊髓前后索相邻，又为同一软脊膜包绕，故CSEP也能间接反映前索情况，说明CSEP与后肢运动功能之间存在一定联系。CSEP的波幅变化个体变异非常大，而潜伏期变化比较恒定，且与损伤程度及功能状态的相关性也较大；潜伏期能够反映神经纤维传导速度，潜伏期延长说明神经纤维传导阻滞，潜伏期缩短说明神经纤维传导速度增快，脊髓神经传导功能恢复[16]，故本研究只检测了潜伏期的变化。结果表明，Brdu+NSCs组与NSCs组CSEP潜伏期除移植后第1天外其余各时间点均较SCI组显著缩短，提示NSCs移植能够促进SCI后神经传导功能的恢复，可能的作用机制是NSCs移植入损伤脊髓后能从细胞结构上与宿主融合，迁移分化成特定的神经元，分泌细胞因子，一方面上调与轴索生长相关的基因，促进受损的神经元轴索再生；另一方面，与其他的神经元建立突触联系，重建神经环路，达到SCI的功能性恢复。

烯醇化酶普遍存在于哺乳动物组织中，其同工酶以αα、ββ、γγ、αγ、αβ 5种形式存在于细胞质中，γγ型特异性地存在于神经元和神经内分泌细胞中(线粒体内)，故命名为NSE[17]。NSE含量由高到低依次位于脑、脊髓、周围神经节，一旦缺血或受损，神经元胞体和轴突的细胞膜完整性发生变化，使细胞内大量蛋白质(包括NSE)迅速进入细胞间隙，胞内的NSE减少，同时在脑脊液和血液内可以检测到NSE。本研究观察到SCI组损伤后NSE免疫阳性细胞灰度值和阳性细胞数明显减少，第3天开始缓慢恢复，同时伴有CSEP-P潜伏期的缓慢缩短，提示NSE的表达不仅能反映脊髓神经损伤的程度，而且也参与了SCI后的修复过程，是脊髓感受伤害性反应的内源性保护剂，但这种自发的内源性的保护作用是有限度的。Brdu+NSCs组与NSCs组除移植后第1天外，各时间点NSE免疫阳性细胞灰度值均高于SCI组，阳性细胞数亦多于SCI组，HE染色亦观察到移植后第28天损伤部位残留细胞形态大致正常，尼氏体增加。相关分析表明，NSE免疫阳性细胞灰度值越高、阳性细胞数越多，SCI后CSEP-P潜伏期缩短越明显，结果提示，NSCs移植能明显上调SCI后NSE的表达，并能通过促进NSE的表达而缩短CSEP-P潜伏期，从而减轻SCI、保护神经功能，进而促进大鼠后肢神经功能障碍的恢复，具体的调控机制尚待进一步深入研究。

综上所述，体外培养的NSCs移植到SCI区域后可存活、迁移，且能明显上调SCI后NSE的表达，并能通过促进NSE的表达而缩短CSEP-P潜伏期，从而促进大鼠后肢功能障碍的恢复。但以上结果与Sham组相比仍有一定差距，表明单纯NSCs并不能得到十分满意的脊髓功能恢复，因而寻求多种方法的联合运用治疗SCI将是我们继续研究的课题和努力的方向。

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