HPLC法测定双唑乳膏中克霉唑与硝酸益康唑的含量*

马若群，丁苏苏，徐兴亚，闻琍毓，李倚云

(1. 扬州市药品检验所，扬州　225009；　2. 扬州市疾病预防控制中心皮肤病性病防治所，扬州　225009)

双唑乳膏是由硝酸益康唑与克霉唑两组分按1∶1配成的乳膏制剂，其中克霉唑与硝酸益康唑分别为吡咯类抗真菌药与咪唑类抗真菌药，均通过干扰细胞色素P-450的活性，从而抑制真菌麦角固醇等固醇的生物合成。现存主要剂型为双唑癣药水[1]，收录于中华人民共和国卫生部药政局编辑出版的《中国医院制剂规范》(西药制剂第2版)。该制剂的两组分联合用药的广谱抗霉菌作用及治疗湿疹、头癣、体癣及手足癣等功效得到了医院临床的认可[2,3]。与药水制剂相比，乳膏制剂具有依从性好、使用方便、性质稳定、溶解性能较好等优点[4]，故双唑乳膏的开发成为一个颇具前景的研究课题。《中国药典》未收载两种成分同时测定的方法，文献报道有关双唑癣药水的含量测定方法多为多波长紫外吸收法[1,5,6]。本文参考《中国药典》中克霉唑乳膏与硝酸益康唑乳膏各自的含量测定方法[7]，建立了以十八烷基键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾与磷酸氢二钾各2.5 g，加水溶解并稀释至1000 ml)-甲醇(25∶75)为流动相的高效液相色谱法同时测定两组分含量，操作简便，结果满意。

1　仪器与试药

Shimadzu LC-20 AB型高效液相色谱仪(SPD-20 A检测器，SIL-20 AC系统进样器，CTO-20 AC型柱温箱，CBM-20 Alite型系统控制器)；梅特勒公司AB135-S电子分析天平；克霉唑对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号100037-200306，规格约50 mg，含量100%，105 ℃干燥2 h后使用)，硝酸益康唑对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号100214-199802，规格约50 mg，含量100%，105 ℃干燥1 h后使用)；双唑乳膏(江苏省扬州市疾病预防控制中心皮肤病性病防治所提供，规格50 g/盒，批号121214、121224)，甲醇为色谱纯(Dikma公司)，水为纯化水。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Alltech Alltima C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：35 ℃；流动相：磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾与磷酸氢二钾各2.5 g，加水溶解并稀释至1000 ml)-甲醇(25∶75)；流速：1.0 ml/min；检测波长：232 nm；进样量：20 μl；理论板数按克霉唑峰计算，不低于4000，克霉唑峰与硝酸益康唑峰的分离度应符合要求。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品储备液的制备精密称取克霉唑与硝酸益康唑各10 mg，置同一100 ml量瓶中，加甲醇75 ml使溶解，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为1号储备液；精密量取1号储备液5 ml，置100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为2号储备液。

2.2.2对照品溶液的制备精密量取1号储备液5 ml，置10 ml量瓶中，用75%甲醇溶解并稀释至刻度，即得。

2.2.3供试品溶液的制备取本品1 g(约相当于克霉唑与硝酸益康唑各5 mg)，精密称定，置100 ml量瓶中，加甲醇75 ml，置75 ℃水浴中温热5 min，时时振摇，取出后强烈振摇5 min，使克霉唑与硝酸益康唑充分溶解，冷却，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却2 h，取滤膜迅速滤过，待续滤液放置至室温，精密量取续滤液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.2.4阴性对照溶液的制备取除克霉唑与硝酸益康唑以外的其他组分，按处方配比配制成阴性对照，按“2.2.3”供试品溶液的处理方法，同法制得阴性对照溶液。

2.3专属性试验精密量取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各20 μl，在上述色谱条件下进行分析，结果显示，克霉唑的保留时间约为9.2 min，硝酸益康唑的保留时间约为13.9 min，样品中其他成分峰不干扰克霉唑与硝酸益康唑的测定，见图1。

2.4线性关系考查分别精密量取“2.2.1”项下的1号储备液2、5、10和15 ml与2号储备液1、2和10 ml置20 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取1、2号储备液与上述溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以克霉唑与硝酸益康唑的峰面积(A)对其浓度(C)进行线性回归，回归方程分别为克霉唑A=2.1629C+1.3954(r=0.9999,n=9)；硝酸益康唑A=2.8602C+1.4205(r=0.9999,n=9)。结果表明克霉唑与硝酸益康唑在0.25～100 μg/ml的范围内与峰面积呈良好的线性关系。

1. 克霉唑　2. 硝酸益康唑

2.5精密度试验取批号为121224的样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液1份，在上述色谱条件下连续进样5次，克霉唑与硝酸益康唑色谱峰峰面积的RSD分别为0.8%与1.0%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2．6检出限与定量限精密量取2号储备液，用流动相逐级稀释至刻度，摇匀。精密量取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果检出在克霉唑与硝酸益康唑的浓度为50 ng/ml时，S/N分别为2.96与5.70，按3倍信噪比计算，将检出限定为50 ng/ml。定量限定为标准曲线的最低点，0.25 μg/ml。

2．7重复性取批号为121224的样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液6份，在上述色谱条件下连续进样2次，克霉唑与硝酸益康唑色谱峰峰面积的RSD分别为0.9%与1.0%(n=6)。结果表明方法的重复性良好。

2．8稳定性取精密测定项下制备的样品溶液，在上述色谱条件下于0、1、2、3、4、6和8 h分别进样，记录各色谱峰峰面积，克霉唑与硝酸益康唑色谱峰峰面积的RSD分别为1.1%与1.4%(n=7)。结果表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.9回收率试验称取批号为121214的样品9份，每份约0.25 g(约相当于克霉唑与硝酸益康唑各1.25 mg)，精密称定，置50 ml量瓶中，精密量取克霉唑对照品19.80 mg与硝酸益康唑对照品20.49 mg，置50 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，量取2、3和5 ml各三份，分别加入上述9个50 ml量瓶中，按“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液。精密量取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示克霉唑与硝酸益康唑的回收率分别为99.87%与101.11%，RSD分别为1.4%与1.8%，见表1和表2。

表1　样品中克霉唑的回收率试验结果

表2　样品中硝酸益康唑的回收率试验结果

2．10供试品含量测定取批号为121224、121214的样品，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行含量测定，以外标法计算含量，结果见表3。

表3　样品含量测定结果

3　讨论

3.1剂型的选择关于克霉唑与硝酸益康唑联合用药取得较好临床效果的报道屡见报端，制成复方剂型可以方便患者使用，提高依从性。而现在唯一存在的复方剂型为双唑癣药水，且仅为医院制剂，涂布不均匀。在临床使用上，乳膏剂具有保护创面、润滑皮肤等天然优势，可以起到更好的治疗效果。并且克霉唑与硝酸益康唑的稳定性较好，制成乳膏剂后的含量测定提纯过程可有效规避样品处理过程中降解情况的发生。

3.2波长的选择根据《中国药典》2010年版二部中克霉唑与硝酸益康唑含量测定项下的规定，两者的检测波长分别为215 nm与232 nm，实际检测中发现两者无显著性差别，而232 nm时两者的吸光度更接近，为避免甲醇截止波长的影响，故选择232 nm作为检测波长。

3.3流动相选择根据《中国药典》2010年版二部中克霉唑与硝酸益康唑含量测定项下的规定，两者的流动相也较为接近，克霉唑为甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(70∶30)(用10%磷酸调节pH值至5.7～5.8)，硝酸益康唑为磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾与磷酸氢二钾各2.5 g，加水溶解并稀释至1000 ml)-甲醇(10∶30)。经比对，后者样品峰形更好，拖尾现象更轻，故采用硝酸益康唑较高浓度的磷酸盐缓冲液。同时调整有机相浓度，使两主峰在15 min之内出峰。最终选择磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾与磷酸氢二钾各2.5 g，加水溶解并稀释至1000 ml)-甲醇(25∶75)为流动相。

本文为克霉唑与硝酸益康唑联合用药的新剂型——双唑乳膏建立了高效液相色谱仪测定双唑乳膏中克霉唑与硝酸益康唑含量的方法。实验表明该方法分离效果良好，方法灵敏度高，专属性强，方法可靠。 建议该方法用于双唑乳膏的含量测定。

1王桂芳, 张守尧, 沈霞, 等. 双波长紫外分光光度法测定双唑癣药水中益康唑克霉唑的含量[J]. 药学实践杂志, 1998, 16(2): 100

2梁宗夏, 王筑, 周淑琴, 等. 硝酸益康唑栓剂联合克霉唑软膏治疗念珠菌阴道炎的疗效观察[J]. 海南医学, 2006, 17(7): 105

3袁惠英. 硝酸益康唑栓剂治疗念珠菌性阴道炎疗效分析[J]. 国际医药卫生导报, 2006, 1(17): 129

4程万清, 叶小文. 乳膏剂的研究进展[J]. 医药导报, 2008, 27(3): 312

5程献,黄立新,朱忠华. 多波长直线回归法测定双唑癣药水中益康唑和克霉唑含量[J]. 广东药学院学报, 1997, 13(4): 256

6王桂芳, 张守尧, 杨海恩. 高效液相色谱法测定双唑癣药水中益康唑和克霉唑含量[J]. 中国医院药学杂志, 1998, 18(4): 157

7中国药典[S].二部.2010: 320,954