骨形态发生蛋白与血小板衍生性生长因子在骨形成中协同作用的研究进展

罗云纲，曲露露，李美华

(吉林大学第二医院口腔科,吉林 长春130041)

骨形态发生蛋白与血小板衍生性生长因子在骨形成中协同作用的研究进展

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罗云纲，曲露露，李美华

(吉林大学第二医院口腔科,吉林 长春130041)

骨形成是成骨细胞和破骨细胞在多种因子存在的微环境中共同作用的结果。骨损伤早期，控制骨祖细胞诱导作用的各种生物化学因素和生物生理学因素起着重要作用，然而在后期促进骨改建的各种细胞因子起主要作用。新近研究表明：各生长因子通过刺激成骨细胞的增殖及其活性，调节局部骨形成作用，然而关于生长因子在调节成骨细胞代谢中的相互作用关系尚不完全清楚。在众多骨生长因子中，骨形态发生蛋白(BMPs)被公认是目前最强的骨诱导因子，而血小板衍生性生长因子(PDGF)对骨改建有双向调节作用，因此，进一步探究BMP和PDGF及其二者在骨形成中的作用意义深远。本文作者探索BMPs和PDGF的化学结构及生物学作用，阐述BMP与PDGF在骨形成中协调作用的明确性和复杂性。

骨形成过程; 骨形态发生蛋白;血小板衍生性生长因子；骨缺损；骨折愈合

骨形成过程是一个从骨形态发生蛋白诱导开始，众多骨生长因子相互协调、相互联系的过程。每一种骨生长因子均有其复杂的作用机制，在骨形成的不同阶段发挥重要作用。因此各种骨生长因子自身生物学作用及其相互作用的研究在骨形成中就显得尤为重要[1]。目前,国内外学者已经对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)与血小板衍生性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)在骨形成中的作用进行了大量研究，关于BMPs论著及综述类文章较多，但有关PDGF与骨形成方面的报道较少，在BMPs和PDGF与骨形成方面的研究仍为空白。而且对于已经取得成果的部分仍有很多方面尚待深入: 如关于 BMPs和PDGF相互作用的具体机制有待进一步阐明; 如何更为科学合理地联用 BMPs和PDGF及选择合适的载体,最大限度地发挥其协同作用促进骨缺损的修复还有待深入探讨。因此本文作者从国内外关注的热点着手，将 BMPs和PDGF及其二者在骨形成中作用的研究做一综述。

1 BMPs和PDGF的化学结构及生物学作用

1.1 BMPs的化学结构和生物学作用 BMPs是转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族的一员[2]，为一类疏水性酸性多肽，相对分子质量为18 000～50 000。目前已确定有47 种以上被分离纯化[3]，广泛存在于骨基质中。BMP 在骨形成方面研究较多的是BMP2、BMP4和BMP7[4]。Rauch等[5]认为：BMP2、4和7 对未分化间充质细胞向成骨细胞的分化起十分重要的作用。1965年，由Urist[6]首先发现将牛的脱钙骨基质植入鼠的肌肉中，可以诱发异位成骨。经过长时间的研究将脱钙骨基质中发现的蛋白命名为BMPs。随后在啮齿动物、狗、羊和人的体内及体外实验中均已证实BMPs 具诱导成骨的作用，无种属特异性,具有跨种属诱导成骨的能力[7-8]。但是BMPs 的用量和诱导时间在不同种属间差异较大。在小鼠股部肌肉中植入0.1 mg·kg-1体质量的BMPs,2～3 周即可出现软骨,大鼠则需4～6 周。20 mg·kg-1体质量的BMPs植入狗颈部肌肉内,8～12 周才出现软骨[7]。研究者[9]提出诱导成骨三要素: 诱导刺激物BMPs、BMPs 的靶细胞——间充质类细胞和有利于骨生长的血供环境。BMPs的主要生物学作用是诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化为软骨细胞和成骨细胞,从而导致软骨和骨的形成[10]。BMPs对已分化成熟的骨和软骨细胞基本上无促进增殖作用，其诱导成骨过程[11]被分为趋化期、分化期、骨质形成期和改建期，在以后的29～30 d内,新生的编织骨经重塑后形成具有骨髓的板层骨,新骨逐渐趋于成熟[12]。尹战海等[13]研究发现：应用BMPs 增强自体骨与单纯自体骨重建股骨头具有不同的骨形成能力，应用单纯自体骨修复股骨头骨缺损仅能发挥成骨支架的作用,而自体骨加BMPs复合移植在术后9 周即可有效地重建股骨头内结构。从分子和细胞水平来说，与转化生长因子一样，BMPs的表达是从胚胎发育及进入成年期。BMPs的主要作用机制为[14]：促进未分化间充质细胞和成骨前体细胞的有丝分裂，诱导成骨细胞表型的表达(增加碱性磷酸酶的活性)和对间充质细胞和单核细胞有趋化作用。朱六龙等[15]评价了腺病毒介导的人BMP-2基因(Adv2h BMP-2) 转染人骨髓间质干细胞(MSCs)的诱导成骨能力。裸鼠肌内注射后4周，Adv2h BMP-2组X线片均有异位成骨,Adv2B gal 转染细胞组未见明显成骨,未转染细胞组仅有少量骨形成；组织学检查发现:Adv2h BMP-2 组可见典型的板层骨和骨髓腔形成,Adv2Bgal 组主要为纤维组织,未转染组也可见散在骨小梁形成。因此，Adv2h BMP-2基因转染可诱导人骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨。BMPs在骨内含量极少，且在体内迅速弥散、降解。近年有学者[16]将BMPs与载体结合组成其释放系统(BMPs/载体)以解决这些问题，如Urist[6]将BMPs/磷酸三钙植入肌肉后诱导的新骨是单用BMPs 的12倍。研究[10]表明：BMPs诱导新骨形成的过程,需要某些激素和生长因子的参与。通过促进成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等多种细胞的增殖和分化,诱导软骨和骨基质的合成,从而促进骨形成。

1.2 PDGF的化学结构和生物学活性 PDGF是相对分子质量为28 000～35 000的多肽,是由A和B 2条多肽链通过二硫键连接组成的杂二聚体。A链相对分子质量为14 000～18 000，B链相对分子质量为16 000，二者有56% 的氨基酸序列相同[17-18]，高度同源。现发现PDGF有5 种亚型，即PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-C 及PDGF-D[18]。PDGF受体(PDGFR)是相对分子质量为160 000～185 000的糖蛋白，有2条链，其在细胞内外均有特异性的功能区，分布在成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞和神经胶质细胞等结缔组织细胞表面[19]。PDGF是1974年被发现的一种刺激结缔组织生长的常见肽类调节因子[20]，是在成纤维细胞、平滑肌细胞和神经胶质细胞刺激增殖的血小板中分离和纯化得到,近几年也观察到其他种类的细胞如内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、成纤维细胞及转化细胞均可产生PDGF[21-22]。PDGF广泛存在于骨组织，在创伤愈合中起重要作用，称作“创伤因子”。已证实血小板聚集时分泌的PDGF 在骨折愈合中起重要作用，而且PDGF 还可作为局部因子[23]调节骨重建过程。作为一种多功能的细胞因子，PDGF以自分泌和旁分泌的方式[24-25]，通过细胞表面的受体细胞传导途径调控细胞的增殖、分化，在许多生理和病理过程中起到重要作用。 PDGF必须与细胞膜上的相应受体结合后才能发挥其生物学效应。PDGF受体是一种跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，由细胞外N端与PDGF特异识别的结构域、单链顺序跨膜的中间疏水结构域和细胞内C端具有酪氨酸蛋白激酶活性的肽段结构域组成。当受体与其配体结合后促使2个受体分子形成二聚体，激活细胞内结构域酪氨酸残基自身磷酸化，或促使激活特殊靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化，从而将信号传入细胞内，经级联式放大瀑布效应调控细胞的生命活动，包括靶细胞的分裂增殖。PDGF受体由2种亚单位α及β构成，二者与PDGF结合力相差很大，α亚单位与PDGF A链及B链有较高的亲和力，而β亚单位仅与B链有高亲和力。所以α亚单位可与PDGF-AA、PDGF-AB及PDGF-BB结合，β亚单位仅与PDGF-BB及PDGF-AB结合。PDGF在骨折愈合早期具有重要作用，低浓度时即对中性粒细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞产生趋化作用，高浓度时促进细胞增殖分化。研究[26]发现：PDGF既可以促进骨形成又可以通过与其他生长因子等相互作用刺激骨吸收，对骨重建具有双向调节作用。目前研究并未发现PDGF具有种属特异性，人和牛骨中的PDGF 表现出类似的生物活性，在胚胎鸡、新生小鼠及大鼠[18，23]颅盖骨细胞培养中,PDGF 均可促进细胞分裂、胶原及非胶原蛋白合成[23]。Fronun等[27]发现：PDGF在牛骨干缺损修复中可加速骨基质生长并提高骨密度。在兔胫骨截骨模型中一次性注射PDGF 到骨折附近,跟踪观察发现骨痂的体积与密度有明显增加。Howes等[28]认为：只需1次局部给药PDGF即可诱发其促进脱钙骨诱导成骨和软骨的作用。PDGF还可通过刺激前列腺素的合成而促进鼠颅骨的骨吸收作用。有学者[29-31]认为：PDGF 与细胞膜上相应受体结合后,可能主要通过以下3个方面的作用促使有丝分裂信号向胞内传递,引起DNA 合成的增加,从而促进细胞的分裂和增殖：① 受体自动磷酸化和在酪氨酸残基上的胞浆底物的磷酸化。受体酪氨酸激酶活化刺激受体上部分酪氨酸磷酸化[29]；②PDGF与其相应受体结合后,使膜内磷脂酶C 活化,刺激脂醇磷脂产生三磷酸脂醇( IP3)和甘油三酯(DAG)。IP3主要对内质网起作用,DAG 则可激活蛋白激酶C (PKC),使胞内相关蛋白磷酸化或分解成乙酰甘油和花生四烯酸[30]；③PDGF可增加胞内Ca2+和Na+/H+的交换,这种改变对细胞分裂很重要[31]。PDGF 可通过刺激细胞的增殖生长而增强成骨细胞的合成分泌功能。

2 BMPs和PDGF在骨形成中的协同作用

随着对BMPs和PDGF研究的不断深入，BMPs和PDGF的协同作用也越来越引起人们的关注。单一的BMPs和PDGF能够刺激新骨的形成，但是不能完善骨细胞增殖和分化的全过程，二者需要彼此的相互协调，甚至能达到相得益彰的结果。

2.1 BMPs与PDGF在骨形成中协调作用的明确性 有学者[19]将牛血小板源性生长因子与猪BMPs用于家兔桡骨中段2 cm骨缺损的修复，结果显示：术后14～18周，PDGF组和复方BMPs组的骨连接率分别为42.9%和72.4%，联合应用PDGF和复方BMP组的骨连接率为100%，提示PDGF与BMPs在加快骨形成方面有协同作用。联合应用BMPs和PDGF或BMPs和bFGF修复骨缺损，其新骨生成量及骨愈合率显著增加。李菊根等[32]应用MTT法分析PDGF对鼠成骨细胞生长作用的影响，结果显示：无论单独应用PDGF,还是与BMPs和bFGF 联合应用对成骨细胞的增殖均有明显促进作用; PDGF 组与联合应用组比较有显著性差异,联合应用组增殖明显,即PDGF 与BMPs、bFGF联合应用在成骨细胞的增殖方面有明显的协同作用。刘浩等[33]构建表达目的基因PDGF-β和BMP-9的重组腺病毒质粒，转染包装细胞HEK293后收获高滴度的腺病毒感染液，研究BMP-9和PDGF-β对MSCs成骨分化的协同诱导作用，结果显示：BMP-9单独使用具有较强的诱导干细胞成骨分化能力，PDGF单独应用并不具有直接的诱导骨分化活性，但与BMP-9联合应用，可在干细胞体外成骨分化过程的中后期发挥明显的协同作用，对新骨组织形成和成骨细胞活性具有明显的协同促进作用，最终增加新生骨组织总的数量和质量。但在认识到BMPs与PDGF的协调作用的同时，研究者还应注意到骨形成过程的复杂性。

2.2 BMPs与PDGF在骨形成中协调作用的复杂性 骨生长因子作为有规律的有序作用的因子，其表达分泌及相互作用还受到时间与空间上的影响。应彬彬等[34]通过对BMPs和PDGF在下颌牵张成骨中的表达模式及生物学意义的研究表明：2种生长因子虽然均参与了机械应力刺激新骨生长的细胞和分子生物学行为,但作用时间可能存在差异; BMPs主要参与牵张早期的细胞分化和增殖活动,而PDGF 对牵张早期成骨和后期的骨改建活动均有调节作用。

综上所述，PDGF和BMPs的协同作用虽然通过多种途径实现，但PDGF和BMPs的协同作用是肯定的。因此研究者需要进一步了解二者的时序作用规律,从各个角度充分认识BMPs和PDGF，做到在临床应用中有的放矢，充分发挥其协同作用，做到合理有效的利用。

[1] 王林红，郑园娜.全反式维甲酸与骨形态发生蛋白的联合成骨作用研究进展[J].口腔生物医学，2012，3(4)：208-211.

[2] Yamaguchi A.Application of BMP to bone repair[J].Clin Calcium,2007,17(2):263-269.

[3] Chubinskaya S,Kuettner KE.Regulation of osteogenic proteins by chondrocytes[J].Int J Biochem Cell Biol,2003,35(9):1323-1340.

[4] Axelrad TW，Einhorn TA．Bone morphogenetic proteins in orthopaedic surgery[J]．Cytokine Growth Factor Rev，2009，5(6): 481-488．

[5] Rauch F,Lauzier D,Croteau S,et al.Temporal and spatial expression of bone morphogenetic protein-2,-4,and-7 during distraction osteogenesis[J].Bone,2000,26(6):611-617.

[6] Urist MR.Bone: formation by autoinduction[J].Science,1965,150(698): 893-899.

[7] 孙玉鹏,张皖清.生长因子与骨愈合[J].中华骨科杂志,1997,17(4):265-267.

[8] Kloos DU,Choi C,Wingender E.The TGF-beta-Smad network : introducing bioinformatic tools[J].Trends Genet,2002,18(2):96-103.

[9] 王 阳.骨折愈合相关因素的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2012，20(8)：724-726.

[10]Valdes MA，Thakur NA，Namdari S，et al． Recombinant bone morphogenic protein-2 in orthopaedic surgery：a review [J].Arch Orthop Trauma Surg，2009，129(12)：1651-1657.

[11]Kawasaki K,Aihara M,Honmo J,et al.Effects of recombinant human bone morphogenetic protein -2 on differentiation of cells isolated from human bone,muscle,and skin[J].Bone,1998,23(3):223-231.

[12]Wang EA,Rosen V,Cordes P,et al.Purification and characterization of other distinct bone inducing factors [J].Proc Nat l Acad Sci USA,1988,8(5):94-98.

[13]尹战海,王坤正,张沈荣,等.骨形成蛋白增强自体骨修复股骨头骨缺损的研究[J].中国修复重建外科杂志,2002,16(2):93-96.

[14]褚 萌.牙槽骨修复再生技术的研究进展[J].临床口腔医学杂志,2007,23(12):757-759.

[15]朱六龙,戴克戎.骨形成蛋白22 基因转染人骨髓间质干细胞诱导异位成骨的实验研究[J].中国修复重建外科杂志,2003,17(2):131-135.

[16]Tamura S，Kataoka H，Matsui Y，et al． The effects of transplantation of osteoblastic cells with bone morphogenetic protein (BMP) /carrier complex on bone repair[J].Bone，2001，2(2): 169-175．

[17]Horner A,Bord S,Kemp P，et al.Distribution of platelet derived growth f act or( PDGF) A chain mRNA,protein,and PDGF alpha receptor in rapidly forming human bone[J].Bone,1996,19(4):353-362.

[18]孙玉鹏,张皖清.生长因子与骨愈合[J].中华骨科杂志,1997,17(4)：265-267.

[19]王 琪,苟三怀.血小板源性生长因子在骨折愈合中的作用[J].国外医学:骨科学分册,2003,24(4)： 207-209.

[20]王强庆,王洁蕊.血小板衍生生长因子在骨折愈合及恶性肿瘤中表达的研究进展[J].中国煤炭工业医学杂志,2013,16(2):339-341.

[21]Fiedler J,Roderer G,Gunther KP,et al.BMP-2,BMP-4 and PDGF-BB stimulate chemotactiemigration of primary human mesenchymal progenitorcells[J].J Cell Biochem,2002,87(3):305-312.

[22]Lind M.Growth factor stimulation of bone healing effects on osteo blast,osteomies,and implants fix ation[J].Acta Orthop Scand Suppl,1998(283): 2-37.

[23]Khan SN,Bostrom MP,Lane JM.Bone growth factors[J].Orthop Clin North Am,2000,31(3):375-388.

[24]Horner A,Born D,Kemp P,et al.Distribution of platelet-derived growth factor (PDGF) A chain mRNA,and PDGF-a receptor in rapidly forming human bone[J].Bone,1996,19(4):353-362.

[25]Andrew JG,Hoyland JA,Marsh DR.Platelet-derived growth factor expression in normally healing human fractures[J].Bone,1995,16(4):455-464.

[26]Moore DC，Ehrlich MG，McAllister SC，et al． Recombinant human platelet-derived growth factor-BB augmentation of new-bone formation in a rat model of distraction osteogenesis[J]．Bone Joint Surg Am，2009，91(8):1973-1984．

[27]Fronun SJ,Wallale S,Tarnow D.Effect of platelet-rich plasma on bone growth[J].Int J Periondontics Restorative Dent,2002,22(1):45-53.

[28]Howes R,Bowness JM,Grotendorst GR,et al.Platelet-derived growth factor enchance demineralized bone metrix induced cartilage bone formation[J].Calxif Tissue Int,1998,42(1):34-38.

[29]Matuoka K,Fukami K,Nakanishi D,et al.Mitogenesis in response to PDGF and bombesin abolished by micro injection of antibody to PIP2[J].Science,1988,239(4840):640-643.

[30]Kelly JD.Haldeman BA,Grant FJ,et al.PDGF stimulates PDGF Teceptor subunit dimerization and intersubunit transphosphorylation[J].Biol Chem,1991,266(4):87-89.

[31]Gestenfeld LC,Chipman SD,Glowacki J,et al.Expression of differential function bym ineralization culture of chicken osteoblast[J].Dev Biol,1987，122(1):49-55.

[32]李菊根,陈建庭,金大地.MTT法分PDGF对鼠成骨细胞生长作用的影响[J].第一军医大学学报，1998，18(3)：231-233.

[33]刘 浩,张闻力.pdgf促进BMP-9诱导的间充质干细胞成骨分化的实验研究[A].第六届西部骨科论坛暨贵州省骨科年会论文汇编[C].贵州：贵阳，2010：138-139.

[34]应彬彬,胡 静,邹淑娟,等.Bmp与pdgf在兔下颌牵张后新骨组织中的时空表达[J].现代口腔医学杂志,2003,17(5):392-394.

1671-587Ⅹ(2013)05-1085-04

10.7694/jldxyxb20130546

2013-04-10

吉林省科技厅基础处面上项目资助课题 (201115097)；吉林省卫生厅基础研究项目资助课题(20115023)

罗云纲(1971-)，男，吉林省长春市人，副教授，口腔医学博士，主要从事口腔牙周病方面的研究。

李美华(Tel：0431-88796882，E-mail：meihl_699@163.com)

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