纤维素酶及纤维素酶多酶复合体的研究进展

杨明明，陈玉林

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

随着畜牧业的发展，饲料资源紧张的矛盾凸显。近年来用于生产饲料的粮食占全国粮食总产量的比例节节攀升，预计到2020 年饲料粮用量占粮食总量的40%以上。与此同时，以木质纤维素为主要成分的农作物的副产品资源丰富，我国仅秸秆的年产量在5×108以上，是粮食产量的1～1.2倍。由于植物细胞壁的纤维素“难降解性”造成自然界存量最大的纤维素资源在畜牧业中没有得到有效利用，甚至成为环境污染物。此外，植物性的能量饲料和蛋白饲料中的木质纤维素不但自身难以降解，而且妨碍其他养分的消化吸收，降低饲料的营养价值，造成有限饲料资源的浪费。利用木质纤维素酶将木质纤维素分解为可利用的养分是开拓饲料资源和提高养分利用率的有效策略[1-5]。

纤维素酶多酶复合体(cellulosome)是存在于以木质纤维素为养分的厌氧微生物中的高效协同降解木质纤维素的多酶复合体[6]，具有在物理空间上聚集纤维素酶系、协同有效的降解木质纤维素的特点[7-9]。纤维素酶多酶复合体结构为纤维素酶的协同高效降解提供了新思路—人工纤维素酶多酶复合体。以下简要综述纤维素酶降解木质纤维素的研究进展。

1 纤维素酶与粗饲料利用

随着畜牧业的蓬勃发展，饲料资源紧张和人畜争粮矛盾日益突出,饲料资源瓶颈成为困扰养殖业持续健康发展的一大难题。与此同时，以木质纤维素为主要成分的农作物的副产品资源丰富，在畜牧业中没有得到有效利用，甚至成为环境污染物[1]。此外，植物性饲料的木质纤维素作为抗营养因子影响消化道养分的消化和吸收，浪费饲料资源。

利用木质纤维素酶将木质纤维素分解为可利用的养分，是开拓饲料资源和提高养分利用率的有效途径。但是，我国畜牧业生产中使用纤维素酶的比例很低，主要是饲用纤维素酶的产量和降解效果都不能满足畜牧业生产的要求。

木质纤维素的降解是纤维素酶系与底物特异吸附、协同作用的结果[2]。目前在饲用纤维素酶的研究和应用中，缺乏纤维素酶系的协同作用及与底物吸附等方面的研究和技术体系。植物细胞壁中的木质纤维素是以纤维素、半纤维素和木质素等的嵌合方式存在，木质纤维素的有效降解需要纤维素酶系和半木聚糖酶的协同作用[3-5]。

因此，通过基因工程方法提高纤维素酶产量降低使用成本，利用木质纤维素酶的协同作用增加降解效果是缓解饲料资源紧张、提高养分利用率的有效策略。

2 纤维素酶及其调控基因

纤维素类物质是地球上产量巨大而又未得到充分利用的可再生资源。纤维素酶系是参与纤维素降解的纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶等的总称。纤维素酶系促进植物细胞壁的降解，使植物细胞内溶物释放，有利于营养物质的消化和吸收。同时，使用纤维素酶制剂可以促进肠道内源酶的分泌，维护动物肠道消化吸收功能的正常。此外，纤维素酶还可以通过降解饲料中的抗营养因子，提高饲料养分利用率，改善动物消化道微生态环境。因此纤维素酶在饲料行业中有十分重要的实用价值[1-2，10-13]。

自然界中，微生物和昆虫都能产生纤维素酶，通过微生物发酵方法是大规模制备纤维素酶的有效途径。不同来源的纤维素酶在组成和酶解能力方面均有差异[3]。目前生产中采用的菌种大多是木霉、曲霉和青霉等，以木霉属的得率最高[14]；而相对于真菌，细菌的纤维素酶分泌能力低(低于0.1 g/L)，且多属于胞内酶或细胞壁粘附性酶，难以进行规模化的生产分离，因此应用具有局限性。但是细菌源纤维素酶却具有自身独特的优势：基因组结构简单，基因背景清晰，容易进行基因工程改造。因此，高活力的细菌酶源，具有良好的研究和应用价值[15-17]。

纤维素酶根据功能不同主要分为葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡聚糖苷酶。葡聚糖内切酶(1,4-D-glueanohydrolase，EC 3.2.1.4)随机水解可溶性纤维素的β-1，4糖苷键，产生大量小分子纤维素；葡聚糖外切酶(1,4-β-D-glucan, EC3. 2.1.91)水解纤维素线状分子末端的β-1，4糖苷键，每次酶解一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)；β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase, EC3.2.1.21)将纤维二糖水解成葡萄糖分子。由于底物的不溶性，在纤维素酶-底物的作用中，缺乏酶与底物形成ES复合物过程。纤维素酶首先特异性地吸附纤维素上，在外切酶作用下使纤维素易于水化，然后内切酶作用于经活化的纤维素，产生短链低聚糖，纤维二糖酶进一步对产物进行分解。这是一个协同作用过程，但该协同水解作用过程并不完全清楚，其机理还有待进一步研究。

自1982年Cellulomonas fimi的纤维素酶基因首次被克隆以来，纤维素酶不断从细菌与真菌中被发现和分离[18]。来源于里氏木霉的纤维二糖水解酶编码基因cbh1和cbh2，纤维素内切酶编码基因eg1,eg2,eg3,eg4,eg5以及葡萄糖苷酶基因bgl2已陆续被报道, 并且在大肠杆菌中实现了异源表达。在其他细菌中也克隆到了不同的纤维素酶基因[4]，从Stropyomyces、Clostridium、Thermoanaerobacter、Themomonspora、Erwinia、Pseudomonas、Cellvibrio、Ruminococcus、Cellulomonas、Fibrobacter和Bacillus中均成功克隆了葡聚糖苷酶的编码基因。从瘤胃细菌Bacteroidessuccinogenes、Butyrivibriosp、Ruminococcusalbus等的基因组中克隆到了纤维素酶基因；嗜纤维梭菌的纤维素内切酶基因EngA、EngB、EngC、EngD和EngE已经测序并实现了异源表达。Kim等[19]克隆了Aquifex aeolicus VF5编码EG的ce18Y基因，并在E.coliXL1 -Blue中成功表达。Hakamada等[20]运用盒式连接介导PCR 和反向PCR 克隆到了基因egl-257。

3 纤维素酶多酶复合体的类型

Lamed等[21]首次从厌氧微生物热纤梭菌(C.thermocellum) 中发现并鉴定了纤维素酶多酶复合体。纤维素酶多酶复合体普遍存在于厌氧细菌和真菌中，它具有类似核糖体的大分子结构，能协调、有序、高效地降解木质纤维素[4，22]。目前发现的纤维素酶多酶复合体中，不仅含有纤维素酶系，而且还含有半纤维素酶，甚至一些大的纤维素酶多酶复合体中还含有果胶酶[8,23-24]。

纤维素酶多酶复合体由含有锚定蛋白域(dockerin)的各种木质纤维素酶和脚手架蛋白(scaffoldin) 构成，其中scaffoldin含有一个或多个粘附域(cohesin)、纤维素结合域(CBM)。木质纤维素酶通过dockerin与scaffoldin上的cohesin特异性结合，组装成纤维素酶多酶复合体，并通过CBM结合木质纤维素[6,8-9，24]。

目前在厌氧微生物的纤维素酶多酶复合体中发现了三种dockerin cohesin对，分别为type I，type II和type III[24]。来自C.thermocellum的CipA蛋白是最早被克隆的纤维素酶多酶复合体脚手架蛋白[25]。CipA含有9个type I cohesin 和1个type II dockerin，9个type I cohesin专一性识别结合木质纤维素酶的type I dockerin, 1个type II dockerin识别细胞壁的type II cohesin[24-27]。细菌的纤维素酶多酶复合体脚手架蛋白分为复合型和简单型[24]。在嗜温性厌氧菌C.cellulolyticum,C.cellulovorans,C.josui和C.acetobutylicum中，纤维素酶多酶复合体通过简单的脚手架蛋白结合6-9个木质纤维素酶形成最简单的多酶复合体。有相当一部分简单的多酶复合体缺乏type II dockerin，可以游离存在于培养基中。在R.flavefaciens中发现了序列和结构不同于type I和type II的dockerin cohesin对，命名为type III dockerin cohesin对[24]。type I，type II和type III的结构域间相互不识别。此外，type I的dockerin cohesin相互作用具有种属专一性，而type II的dockerin cohesin识别可以跨越种属。

自然存在的纤维素酶多酶复合体在物理空间上聚集于木质纤维素表面，多种木质纤维素酶局部高浓度的协同作用，从而高效的降解木质纤维素。显然，纤维素酶多酶复合体的结构和作用方式为饲用木质素的高效降解提供了一个新的策略—多酶复合体的协同高效降解。

4 纤维素酶多酶复合体的构建

在纤维素酶多酶复合体中，参与降解木质纤维素的酶如果排列组合适当，在保证浓度的条件下，可以高效协同的降解木质纤维素。因此，近年来提出了人工设计型纤维素酶多酶复合体的概念[24，28-29]。利用设计型纤维素酶多酶复合体可以对不同结构域的功能、不同酶的协同效果、多酶空间聚集效应和底物靶向结合作用等进行可行性的检测和评价。采用DNA重组技术构建携带粘附域的脚手架蛋白基因和携带锚定域的纤维素酶基因，表达纯化后在体外组装成期望的多酶复合体。采用重组的脚手架蛋白可以将携带有对应的锚定域的纤维素酶整合入纤维素酶多酶复合体，利用这一方法Fierobe等[10,22]设计了一系列含有两种粘附域的脚手架蛋白，在体外组装了75种含两种纤维素酶的双酶复合体。除了利用来源于自然界多酶复合体中的纤维素酶进行人工设计型纤维素酶多酶复合体的组装，一些游离纤维素酶也可以通过基因工程方法用于纤维素酶多酶复合体的构建。来源于C.thermocellum，Thermobifidafusca和Neocallimastixpatriciarum的游离纤维素酶通过嫁接锚定域的方法与人工设计的脚手架蛋白成功的组装了纤维素酶多酶复合体[30-32]。

在体外设计型的纤维素酶多酶复合体中，三酶复合体的协同作用远大于双酶复合体。利用来源于Clostridiumcellulolyticum的纤维素内切酶和外切酶以及C.thermocellum的木聚糖酶构建的三酶复合体对木质纤维素的降解效率是只含两种纤维素酶的双酶复合体的6倍[10]。即使将三种自由酶混合，其作用效果也只有三酶复合体的1/4。利用T.fusca的木聚糖酶(Xyn11A 和 Xyn10B)和纤维素酶Cel5A构建的三酶酶复合体分解麦秸木质纤维的试验中也表现了相似的协同作用[32]。Cha等[33]比较了Clostridiumcellulovorans的多酶复合体上含有1、2和4个粘附域时的纤维素酶的比活力，发现随粘附域数量的增大，比活力依次为游离酶的1.2、1.3和1.8倍。Moraïs等[34]将来源于Thermobifidafusca的四种游离木聚糖酶 (Xyn10A, Xyn10B, Xyn11A和 Xyl43A) 通过DNA重组分别嵌合4种不同的type I 锚定域(分别来源于R.flavefaciens，C.thermocellum，A.cellulolyticus和B.cellulosolvens)，得到的4种重组的木聚糖酶。同时设计构建含4种相应粘附域的脚手架蛋白，组装成多酶复合体。这种4组分的设计型纤维素酶多酶复合体的降解效率提高了25%。该研究小组进一步用纤维素酶(Cel48A 和Cel5A )和木聚糖酶(Xyn10A和Xyn10B)构建多酶复合体，其对秸秆纤维的降解是游离混合酶的2.6倍，4组分多酶复合体的效率是两种双酶复合体混合物的2倍[5]。采用同样的设计型多酶复合体的构建方法，6组分的纤维素酶多酶复合体(含Xyn10A, Xyn10B, Xyn11A，Xyl43A，Cel48A 和Cel5A)对未处理的秸秆的降解是混合酶的1.6倍，同时比来源于Clostridiumthermocellum的天然纤维素酶多酶复合体的效率提高33%～42%[35]。可见，设计型纤维素酶多酶复合体可以对不同酶系的木质纤维素酶进行组合，增加协同作用，大幅度的提高木质纤维素的降解。

然而，体外构建的设计型纤维素酶多酶复合体是通过分别表达、纯化脚手架蛋白和纤维素酶等组分，然后在体外组装成多酶复合体，生产成本高，无法在生产中大规模应用。利用基因工程技术在宿主细菌中高效表达重组脚手架蛋白和各个木质纤维素酶，直接组装多酶复合体，对木质纤维高效降解具有重要意义。最近，Wen等[36]和Fan等[37]在酵母中实现了双酶和三酶复合体表达，其中三酶复合体的活性高出约8.8倍。

纤维素酶多酶复合体为提高木质纤维素的有效降解提供了新的策略，最近Resch等[38]采用真菌的自由酶和纤维素纤维素酶多酶复合体协同降解预处理的秸秆，自由酶和多酶复合体展现了显著的协同降解效果。

5 结 语

木质纤维素的巨大存量和饲料资源紧张的矛盾，使得有效降解木质纤维素成为现代畜牧业可持续发展亟待解决的问题。随着纤维素酶的深入研究，多酶系及多酶复合体的协同作用为有效降解木质纤维素提供了有效的方法。结合现代生物技术获得高效协同降解作用的多酶复合体，结合木质纤维素降解特点得到不同酶系的组合方案是解决木质纤维素利用问题的关键有效技术思路。

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