125I－USPIO－bevacizumab用于肝细胞肝癌的SPECT／CT／MRI多模态显像研究

赵焱昭 姚琦 吴冰 谭辉 邬鹏跃 张春富 程登峰 石洪成

（1.复旦大学附属中山医院核医学科，上海 200032；2.上海市影像医学研究所，上海 200032；3.上海交通大学Med－X研究院，上海 201101）

肝细胞肝癌（HCC）的早期诊断和治疗非常重要，肿瘤直径大于2 cm而不超过2 cm的HCC患者行肝癌切除术后5年生存率接近100%；肿瘤直径不超过5 cm以及大于5 cm的HCC患者行肿瘤切除术后5年生存率分别为63.7%和34.9%［1－2］。影像学检查是早期诊断HCC的重要方法。然而，单一的影像学技术对于诊断HCC有许多局限，如能联合应用其他多种成像技术，则可实现优势互补，为诊断HCC提供更加精确、全面的信息。本研究用直径小于20 nm的超小超顺磁性氧化铁颗粒（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）偶联bevacizumab，合成 USPIO－bevacizumab，再经125I标 记，合 成125I－USPIO－bevacizumab，将 其 作 为SPECT／MRI双模一体靶向肿瘤细胞的分子探针，对HepG2 HCC模型鼠进行活体SPECT／CT及MRI显像，以探讨其用于HCC多模态显像的潜力。

1 资料与方法

1.1 仪器 NanoSPECT／CT（美国Bioscan公司）；Magnetom Trio 3.0T超导型磁共振成像仪（德国Siemens公司）；CRC－15R活度计（美国Capintec公司）

1.2 试剂USPIO由上海交通大学Med－X研究院提供；bevacizumab购自瑞士Roche公司；二乙基三胺五乙酸（DTPA）、1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N－羟基琥珀酰亚胺 （NHS）、吐温、二乙基三胺五乙酸二酐（DTPA二酐）、四氯二 苯 基 甘 脲 （Iodogen ）、COOH－PEG－COOH、COOH－PEG－NH2购自美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液（PBS）购自北京索莱宝科技有限公司；高锝酸钠（Na99mTcO4）淋洗液、碘125－碘化钠（Na125I）溶液购自上海欣科医药有限公司；Whatman 3MM层析色谱纸购自美国GE公司；二氯甲烷、氯化亚锡、丙酮购自上海红星试剂厂。

1.3 细胞 人HCC细胞株HepG2由复旦大学肝癌研究所提供。用DMEM培养基（内含体积分数为10%小牛血清、青霉素100 U／mL和链霉素100 μg／mL）在37℃、CO2体积分数为5%的条件下培养HepG2，每隔48 h换液1次；用0.05%胰酶（含0.02%EDTA）消化，并传代。

1.4 裸鼠HCC皮下移植瘤模型的建立 SPF级Balb／c雄性裸鼠（4～6周龄，15～20 g）购自复旦大学实验动物科学部。收集对数生长期的HepG2细胞，用0.1 mol／L的PBS调节细胞浓度至1×108个／mL；在Balb／c雄性裸鼠左肩处皮下注射0.1 mL细胞悬液；当肿瘤体积达100～300 mm3时（注射后1～2周），对荷瘤裸鼠行相关动物实验。所有动物实验研究均遵守复旦大学附属中山医院实验动物管理规范。

1.5 USPIO－bevacizumab的合成 USPIO－bevacizumab的合成路线如图1所示。实验流程：以0.01 mol／L PBS（pH＝7.4）为溶剂配制 COOH－PEGCOOH 及COOH－PEG－NH2溶液，浓度均为1 mg／mL。将 2 mL COOH－PEG－NH2、2mL COOHPEG－COOH、4 mL Fe3O4透析液以及22 mL0.01 mol／L PBS（pH＝7.4）混合，配制30 mL USPIO混合液，室温下超声1 h。

图1 USPIO－bevacizumab的合成路线

将上述30 mL USPIO（20μg／mL）混合液置于最大分离范围为10 kD的超滤管中，以5000 r／min离心10 min，离心后上层剩余溶液约5 mL；再加入PBS5 mL，5000 r／min离心10 min，重复2次，除去游离的PEG；然后将离心后残留液体转移至最大分离范围3 kD的超滤管中，6000 r／min离心15 min，此时管中残留液体约2 mL；将剩余溶液静置后可观察到沉淀，上清液呈深棕色，为COOH－PEG－NH2／Fe3O4／COOH－PEG－COOH 纳米磁流体。

向8 mL PBS中加入2μL吐温并混合；将10 mg EDC和10 mg NHS溶于200μL该混合液；将200μL含有EDC和NHS的溶液加入到前述离心后得 到 的 2 mLCOOH－PEG－NH2／Fe3O4／COOH－PEG－COOH纳米磁流体中；溶液振荡30 min后转移至最大分离范围3 kD的超滤管中，6000 r／min离心5 min；加入25 mg／mL的bevacizumab50μL，在37℃的恒温培养箱中以250 r／min的速度振荡2 h；得到 USPIO－bevacizumab 1.5 mL，其中含铁0.15 mg，bevacizumab 1.25 mg。

1.6125I标记bevacizumab及 USPIO－bevacizumab在涂有Iodogen（约10μg）的反应管中依次加入2 μL bevacizumab（25mg／mL）、50μL Na125I的 PBS溶液（370 MBq／mL，PBS：0.05 mol／L），轻轻混匀后，室温反应10 min。用甲醇和水的混合溶液作为展开剂，用Whatman3mm层析试纸为固定相测定标记率，125I－bevacizumab的Rf＝0，Na125I的Rf＝0.8。

1.7 HepG2荷瘤裸鼠显像

1.7.1 注射125I－bevacizumab后 HepG2荷瘤裸鼠的NanoSPECT／CT显像 荷瘤裸鼠的 Nano－SPECT／CT显像在复旦大学附属肿瘤医院核医学科进行。取1只HepG2荷瘤裸鼠，经尾静脉注射100μL含37 MBq125I－bevacizumab的PBS溶液；分别在注射后2 h以及24 h腹腔注射100μL2.5%巴比妥钠麻醉裸鼠，行NanoSPECT／CT全身显像，监测小鼠体内肿瘤对125I－bevacizumab的吸收情况。小鼠在进行SPECT显像之前首先进行CT扫描，CT扫描参数：帧分辨率256×512，球管电压45 kVp，电流0.15 mA，曝光时间500 ms／帧，小鼠全身扫描时间约为7 min；在采集图像的同时采用Nucline 1.02软件（匈牙利Mediso公司）进行实时图像3D重建。CT扫描结束后，进行同机SPECT扫描，SPECT扫描选用4个高分辨9孔板，配合锥形准直器同时实现图像的高分辨及高灵敏度，能峰28 keV，窗宽10%，扫描参数选择1 mm／pixel的分辨率、256×256的矩阵排列以及24个投影和60 s扫描时间，小鼠全身扫描约需24 min；扫描完成后，采用Hi－SPECT软件 （美国Bioscan公司）进行3DOSEM重建图像，重建算法采用4个子集及6次迭代计算，重建分辨率为0.4 mm／pixel。

1.7.2 注射125I－USPIO－bevacizumab后 HepG2荷瘤裸鼠的NanoSPECT／CT显像 取1只HepG2荷瘤裸鼠，经尾静脉注射含100μL37 MBq125I－USPIO－bevacizumab的PBS溶液，分别在注射后2 h以及24 h腹腔注射100μL2.5%巴比妥钠麻醉裸鼠，行NanoSPECT／CT全身显像，监测小鼠体内肿瘤对125I－USPIO－bevacizumab的吸收情况。采集和重建处理参数见1.7.1。

1.7.3 注射 USPIO－bevacizumab后 HepG2荷瘤裸鼠的3T Trio磁共振成像 磁共振成像在华东师范大学认知神经科学研究所进行：取1只HepG2荷瘤裸鼠，经腹腔注射100μL2.5%巴比妥钠麻醉，采用3T Trio磁共振成像系统行全身显像；然后经尾静脉注射含100μL USPIO－bevacizumab的PBS溶液，24 h后腹腔注射100μL2.5%巴比妥钠麻醉裸鼠，采用3T Trio磁共振成像行全身显像，监测小鼠体内肿瘤对USPIO－bevacizumab的吸收情况。2次3T Trio磁共振成像的扫描参数一致，均为：TR＝1500 ms，TE＝75 ms，FOV＝75 mm×100 mm，矩阵 ＝192×256，层厚 ＝2 mm。扫描完成后，所有磁共振图像经目测均匹配相应层面的模型鼠肿瘤信号改变。

1.8 免疫组化染色 尾静脉注射125I－USPIO－bevacizumab的荷瘤裸鼠行NanoSPECT／CT显像后断颈处死，取肿瘤组织，经质量浓度为4%的甲醛固定，石蜡包埋，以4μm的厚度连续切片，分别作VEGF和CD34免疫组化染色。

2 结 果

2.1 以125I－bevacizumab为分子探针的HepG2荷瘤裸鼠的NanoSPECT／CT显像 通过纸层析法测得125I－bevacizumab的标记率为92.5%。HepG2荷瘤裸鼠注射125I－bevacizumab 后，2 h 及 24 h 的SPECT／CT显像（图2），在这两个时间点均可见明显的肿瘤放射性浓集；从2 h到24 h，背景放射性逐渐降低，感兴趣区（ROI）定量分析显示，肿瘤的放射性吸收（ID%）从2.3% （2 h）上升至2.5% （24 h）。

图2 HepG2荷瘤裸鼠注射125I－bevacizumab后2h（A）和24h（B）NanoSPECT／CT显像

2.2 以125I－USPIO－bevacizumab 为分子探针的HepG2荷瘤裸鼠的 NanoSPECT／CT显像HepG2荷瘤裸鼠经尾静脉注射125I－USPIO－bevacizumab后，2 h及24 h行NanoSPECT／CT显像（图3），在这2个时间点肿瘤组织均有放射性摄取；ROI定量分析发现，肿瘤组织的放射性吸收（ID%）为0.54%（2 h）和1.04%（24 h），背景的放射性摄取随时间延长逐渐降低。

图3 HepG2荷瘤裸鼠注射125I－USPIO－bevacizumab后2h（A）和24h（B）NanoSPECT／CT显像

2.3 HepG2荷瘤裸鼠注射 USPIO－bevacizumab后的3T Trio MRI显像 HepG2荷瘤裸鼠尾静脉注射USPIO－bevacizumab前后均行3T Trio MRI T2 WI加权显像（图4）。注射显像剂后，模型鼠肝脏与肿瘤组织同一层面的信号均较注射显像剂前低，显示为明显的T2效应（信号丢失）。可通过肿瘤部位和肝脏区域的不同减低程度来勾画出感兴趣区。

图4 HepG2荷瘤裸鼠注射USPIO－bevacizumab前（A）和注射后24h（B）的3TTrio MRI显像

3.4 HepG2荷瘤裸鼠注射125I－USPIO－bevacizumab后的免疫组化染色 CD34在HepG2肝癌组织间的血窦内皮细胞的胞质内呈强表达，显示为强棕黄色，表明有新生血管的存在；肝癌细胞的胞质内弥漫表达VEGF，表达强度为中等。

图5 HepG2荷瘤裸鼠注射125I－USPIO－bevacizumab后免疫组化染色：CD34（A），VEGF（B）

3 讨 论

HCC的功能性核医学显像手段主要包括PET和SPECT。PET具有高灵敏度以及高分辨率的特点，对早期诊断HCC有较高价值；然而，目前最常用的PET显像剂氟代脱氧葡萄糖（18F－FDG）用于HCC的诊断时，阳性检出率仅为50%［3］。其他的PET分子探针，如11C标记的乙酸盐（11C－acetate）、胆碱（11C－choline）与FDG比较，阳性检测率有所提高，但是，它们均不适用于体积较小、分化程度较高的恶性HCC以及肿瘤转移灶的检测［4］。MRI对于HCC的诊断及预后评估有较高的价值，可提供精确的解剖影像，且具有低电离辐射、高软组织对比度和灵敏度等优点。然而，尽管MRI诊断HCC的敏感度达80%，但仍有30%～50%的肝内病灶（直径大多＜2 cm）被漏诊［5］。目前，钆、铁等的造影剂已经被应用于MRI分子影像领域。USPIO作为MRI阴性造影剂，能在T2 WI上表现为低信号，具有良好的T2 WI加权成像的对比增强效果，因此已用作MRI的分子探针［6］。

多模态成像技术能够同时提供高特异性的功能成像信息和高灵敏度、高对比度的解剖成像信息，优于任何一种单一形式的影像技术。目前，PET／SPECT／MRI多模态成像技术，尤其是在多模态纳米探针的研究方面，已取得很大进展［7］。USPIO共价耦联间皮素表达的结合抗体mAbMB并进行111In标记的产物111In－mAbMB－USPIO已被应用于胰腺癌肿瘤的SPECT／MRI研究［8］。经DTPA修饰的USPIO偶联乳糖酸并进行99mTc标记的产物99mTc－DTPA－SPION－LBA也已被应用于HepG2肝细胞癌的SPECT／MRI双模态显像前期研究［9］。

VEGF与HCC的发展及转移密切相关［10］，故选择VEGF作为HCC显像的靶点有利于提高显像的特异性并有助于肝癌的分期诊断及疗效评价。bevacizumab是美国食品和药物管理局（FDA）批准的第一个抗血管生成类抗体药物，能特异性地结合VEGF－A。目前，标记111In和89Zr的bevacizumab已被成功用于宫颈癌的SPECT以及PET显像［11］。

通过以上分析发现，以bevacizumab作为靶向分子，偶联USPIO并进行同位素标记，可以作为SPECT／PET／MRI显像剂并能很好地用于 HCC显像。采用与124I核素原子结构及标记方法类似的125I核素标记纳米颗粒进行SPECT以及MRI显像，具有一定的研究价值。

本研究中，HepG2荷瘤裸鼠注射125I－bevacizumab后，肿瘤部位呈现出明显的放射性浓集，且随着时间的延长，放射性浓集进一步加强，显示了125I－bevacizumab的肿瘤靶向性及特异性。HepG2荷瘤裸鼠注射125I－USPIO－bevacizumab后，肿瘤的摄取较注射125I－bevacizumab后弱，而在肝脏的放射性浓集较125I－bevacizumab注射后进一步增强。肝脏保持较高的放射性浓集与正常肝脏中大量枯否细胞（Kupffer cell）对纳米颗粒的吞噬作用有关。但是，我们也发现，直接应用125I标记的bevacizumab显像时，放射性信号主要集中在肿瘤组织的边缘；然而，125I标记的bevacizumab与USPIO偶联后，放射性信号可在肿瘤的中央部位发现，在实体瘤内部分布更加均一；这符合纳米颗粒在实体瘤内的高通透性和滞留效应（EPR效应）。尽管本研究中肝脏放射性背景较高，但因肿瘤对125I－USPIO－bevacizumab的吸收主要是与肿瘤组织新生血管内皮细胞及肿瘤细胞分泌的VEGF有关，故通过该特异性浓集能反应肿瘤的生长情况。仅通过SPECT显像难以精确勾画出肿瘤组织，本研究以USPIO作为bevacizumab的载体，因USPIO为磁性四氧化三铁，当纳米颗粒直径小于30nm时则具有超顺磁性，故可用于MRI显像（本实验采用的USPIO经光镜分析微粒直径小于20nm）；因此，借助 MRI T2 WI加权显像对ROI进行勾画，再借助融合软件对SPECT的吸收进行定量分析，可对HCC的病理学进程进行活体在线定量分析。

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