盐酸克伦特罗检测方法的研究进展

王秋平，哈 婧，刘 硕，张佳丽，苏 萌

（河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄 050018）

盐酸克伦特罗俗称瘦肉精，为白色结晶性粉末，可促进动物生长，改善动物体内脂肪分配，增加瘦肉率；其易被动物吸收，在动物体内残留时间长，容易蓄积［1］。人类食用含有盐酸克伦特罗的肉后会出现心跳过快、四肢肌肉颤动等中毒症状。由于一般的烹调方法不能将猪脏器和肉中残留的“瘦肉精”的毒性破坏或损耗，以致残留的盐酸克伦特罗超量而引起的食物中毒事件屡有发生［2－3］。虽然中国已禁止其作为生长促进剂使用，但有些不法分子仍在违规使用，影响了中国畜禽产品的质量，对人们的食用安全造成严重危害。因此，研究动物组织中盐酸克伦特罗残留量快速、灵敏的检测方法对保障人们的食用安全具有重要意义。

目前已用于盐酸克伦特罗检测的方法主要有免疫分析法、色谱分析法及各种联用技术分析法等。有关盐酸克伦特罗残留检测的国标方法有3种，分别为酶联免疫吸附测定法（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱－质谱联用法（GC－MS）。

1 免疫分析法

1.1 酶联免疫吸附测定法（ELISA）

ELISA 测定盐酸克伦特罗残留量是利用抗原抗体的特异性反应，以酶催化底物等方法作为显示系统，用微孔板等作为反应、分离载体的一种生物学检测方法，是快速筛选检测动物肌肉、尿液、肝脏等样品中盐酸克伦特罗残留的方法之一。陈穗等用ELISA 对样品检测，定性检出克伦特罗的质量浓度（以下文中如无特别说明，均用质量浓度表示盐酸克伦特罗或克伦特罗的实验结果）为0.03ng／mL，定量检测结果为0.1ng／mL；在0.1～8.1ng／mL 范围内具有良好的线性相关关系，相关系数为0.991 3；当克伦特罗标准品添加水平分别为0.5，1.0ng／mL 时，平均回收率分别为84%，90%［4］。上述指标均符合残留分析质量控制的要求。谢炯炯等测定猪肝、猪尿中违禁药物克伦特罗残留量影响的实验结果表明，北京望尔生物技术有限公司与德国拜发公司生产的2种ELISA 试剂盒具有操作简单、敏感度高、成本低、时间短等特点［5］。

ELISA 是酶免疫分析法（EIA）中较高效的技术，能在短短几小时内检测上百个样品，且不需要复杂的仪器设备，具有样品前处理简单、特异性强、灵敏度高等优点；但常用的ELISA 的检出限与盐酸克伦特罗的允许最大残留量均为0.1μg／kg（质量分数），因此ELISA 难以达到检测要求。

1.2 化学发光酶免疫分析法（CLEIA）

化学发光酶免疫分析方法将高灵敏度的化学发光和高特异性的免疫分析结合起来，具有成本低、特异性强、灵敏度高等优点。RODA 等采用间接竞争化学发光酶免疫分析法对猪尿样中的盐酸克伦特罗进行了检测，检测灵敏度分别为0.08μg／L，但方法只限于猪尿样中盐酸克伦特罗的测定［6］。徐晓婴等优化了检测方法的反应温度、反应时间、缓冲体系的pH 值、离子强度、Tween－20 的浓度等参数，该方法的理论检测限为0.001 4μg／L，线性检测范围可达到0.04～42.5μg／L。批内、批间变异系数均小于10%，回收率为95%～110%，同时有较高的特异性；优化后的检测方法可适用于大浓度范围内的检测，并且此方法完全符合盐酸克伦特罗残留检测的要求［7］。王硕等建立了直接竞争化学发光酶免疫法检测猪肉中盐酸克伦特罗残留，检测时间较ELISA节省了近30min，灵敏度可达0.02μg／kg（质量分数），平均回收率为83%～98%，可用于实际猪肉样品中盐酸克伦特罗残留的快速检测，同时不受莱克多巴胺、沙丁胺醇等同属β－兴奋剂类的违禁兽药的影响；该方法操作步骤较少、样品前处理简便、准确度高、所需设备易于普及，具有一定的应用潜力［8］。

1.3 滴金免疫技术（DIGFA）

应用竞争抑制免疫层析的原理，样本中的盐酸克伦特罗在流动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和盐酸克伦特罗蛋白偶联物的结合。如果检测样本反应的颜色浅于标准检测线的颜色，结果为阳性。颜色越浅表示含量越高。张慧嫦等建立的胶体金免疫层析法可用于快速检测组织样品中盐酸克伦特罗残留量，检测猪肉等组织试样时，结果以颜色直观显示，最低灵敏度值可达到0.5ng／mL，只需3～5min，与莱克多巴胺、沙丁胺醇的交叉反应率为0.86%［9］。目前国内已有多家公司开发出商品化的盐酸克伦特罗快速检测试纸条［10］。

此法检测盐酸克伦特罗操作简便、观察直观，适用于批量筛选、宰前检疫等现场检测，且操作过程仪器化低［11］，解决了过去不能现场检测定性和及时进行处理的难题，具有良好的应用前景。

1.4 生物传感器法（BS）

生物传感器是将生物感应元件的专一性、敏感性与一个能够产生和待测物浓度成比例信号的传导器结合，利用各种生物材料或生物代谢产物如酶、抗体等做成的用于检测、识别食品与生物的化学成分的传感器［12］。吕会田等应用生物化学和免疫学方法，构建了基于量子点标记的ATP 合酶分子马达免 疫 旋 转 生 物 传 感 器（immuno－rotary biosensor，IRB），结合荧光技术，利用中国科学院生物物理研究所张仲伦老师研发的BPCL 弱光检测器实现了对盐酸克伦特罗的检测，该法快速、感应灵敏度可达10－12g／L（文献值一般为10－9g／L）［13］。

国外已有生物传感器技术检测盐酸克伦特罗残留，该技术实现了超微量检测的可能，大大加快了检测速度，使得对盐酸克伦特罗的检测向全自动无试剂检测方向更近了一步。

1.5 放射免疫分析法（RIA）

RIA是一种对微生物受体进行标记，将RIA 和ELISA、生物发光技术、化学发光技术相结合进行检测的新型检测技术［14］，检测限可达到0.5ng／mL的水平。目前国外已有RIA测定CL的试剂盒产品［15］。

放射免疫分析技术虽然具有操作简便、特异性强、灵敏度高、易标准化等优点。但是由于所用仪器较昂贵，对实验条件要求较苛刻，必须使用放射性同位素标记盐酸克伦特罗，且放射性同位素对人体有一定的伤害，从而限制了该法的广泛应用，不属于目前主要的分析方法。

1.6 时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）

以稀土元素为信号放大标记物，结合抗原抗体反应的特异性和Eu3＋标记信号的高灵敏度，可以实现违禁药物的痕量检测。樊晓博等建立Eu3＋标记抗原直接竞争TRFIA，以自制盐酸克伦特罗单克隆抗体包被96 孔微孔板作为固相抗体，Eu3＋标记抗原与样品中的CBL竞争结合抗体，建立直接竞争荧光免疫分析体系；组织、猪尿样品添加回收率实验结果：样品回收率为91%～101%；方法灵敏度为0.02 μg／L，与莱克多巴胺、沙丁胺醇、马不特罗等结构类似物的交叉反应率均小于1%，说明抗体特异性较强［16］。盐酸克伦特罗Eu3＋标抗原直接竞争时间分辨免疫检测法操作简单、灵敏度高、特异性强，可以完全符合现有实际检测需求。

与放射免疫分析法（RIA）相比，时间分辨荧光免疫分析技术具有很多优点：灵敏度高（10－19mol／L），稳定性好，克服了放射性荧光物质的不稳定性，动态范围宽，无放射性危害等，时间分辨荧光分析技术目前被公认为是灵敏度最高的分析方法之一。

2 色谱分析法

2.1 高效液相色谱法（HPLC）

HPLC法分析盐酸克伦特罗时不需要衍生化，利用反相C8或C18色谱柱检测β－激动剂类物质。张群等采用固相萃取柱过柱净化，固定相为ODS－C18，流动相为0.02mol／L磷酸二氢钠缓冲液（pH 值为6.0）－甲醇（体积比为60∶40），流速为0.8mL／min，进样量为10μL，二极管阵列检测器，检测波长为210nm，利用峰面积进行多点标准法定量。线性浓度范围为0.01～1.0μg／mL，相关系数为0.998 9，检测限为0.01μg／mL［17］。

中国已将HPLC 法作为检测盐酸克伦特罗残留的半确证方法。其优点是检测假阳性率低、精确度高、成本低、速度快，适合大批量快速检测。最低检测限为1～15ng／g（质量分数），而且与GC－MS法相比样品不必衍生化，是目前较常用、较成熟的检测方法。

2.2 气相色谱－质谱联用法（GC－MS）

气相色谱－质谱联用法是最常用的盐酸克伦特罗测定方法，现作为中国测定动物组织中盐酸克伦特罗的确证性方法（NY／T468－2001），具有准确度高、灵敏度高、假阳性率低等特点。

王培龙等利用分子印记聚合物（MIP）的分子识别能力，选择性提取、净化并富集猪尿液中的盐酸克伦特罗成分，同时除去干扰物，减少基体抑制作用；用N，O－双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，毛细管气相色谱－质谱联用（选择离子模式，选择离子为277，262，243和86）对衍生物分析；不同盐酸克伦特罗加入量的回收率为71.0% ～89.3%；检出限为0.51μg／L，定量限为1.00μg／L；相对标准偏差为3.2%～9.7%，重复性良好［18］。林维宣等建立了动物组织中10 种β－兴奋剂残留量的GC－MS检测方法；样品经pH 值为5.2的乙酸钠溶液提取，提取液依次经异丙醇－乙酸乙酯（体积比为40∶60）混合溶剂和异丙醇－叔丁基甲醚（体积比为1∶5）混合溶剂萃取净化，再经Strata－X－C 阳离子交换柱（500mg，3mL）净化后，m（TMCS）∶m（BSTFA）为1∶99 的衍生剂衍生，采用HP－5MS 色谱柱进行GC－MS法分析，兼顾各成分灵敏度的情况下，优化质谱的一系列条件，建立了最佳质谱分析条件；10种β－兴奋剂类兽药室内平均回收率为59.1%～77.4%，变异系数为0.87%～7.04%，检出限为1～5μg／kg（质量分数）；方法的回收率、检测限和精密度等技术指标满足国内外对β－兴奋剂残留量检测的有关要求［19］。

GC－MS与HPLC法相比，假阳性率更低，可以准确地在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析；但其衍生化操作繁琐，增加了结果的不确定度，使得GC－MS的应用受到一定限制。

2.3 液相色谱串联质谱法（HPLC－MS－MS）

LEHNER 等采用250 mm×2 mm 的Luna phenyl柱子，用含0.05%（体积分数，下同）甲酸和5%（体积分数，下同）的乙腈水及含0.05%甲酸的乙腈为流动相，在0.45mL／min的流速下进行梯度洗脱，使用ESI－MS／MS检测器进行多反应检测，检测母离子质荷比（m／z）为277，子离子m／z为277，259，204，64的产物离子，氘代的克伦特罗作为内标物，检测限可达4pg／mL［20］。汪辉等建立了高效液相色谱串联质谱测定加工肉制品中莱克多巴胺和克伦特罗的方法；采用阳离子交换色谱柱（SCX）分离目标化合物，改进了前处理方法，采用PXC 固相萃取柱净化，并对洗脱溶液和高效液相色谱串联质谱的各参数进行优化；检出限和定量下限分别不超过0.04μg／kg（质量分数）和0.015μg／kg（质量分数）。样品平均加标回收率为72%～98%。质谱检测器灵敏度高，特异性好，可应用于加工肉制品中兽药残留的批量检测［21］。

2.4 高效薄层色谱法（HPTLC）

高效薄层色谱法已成功应用于肉食品中兽药残留的检测，并能进行定性定量研究［22］。黄宝华等采用薄层扫描法测定猪肝中克伦特罗残留量，展开剂为m（乙酸乙酯）∶m（甲醇）∶m（醋酸）为8∶1∶0.8，GF254板为载体，克伦特罗的Rf值为0.81。线性范围为0.004～0.050μg，回收率为86.5%～94.9%，RSD 值为5.0%～5.8%（n＝6）［23］。该法优点是多样品同时一次测定，快速且高效，分离出的样品可进行其他验证分析；缺点是样品准备时间长，抗干扰能力弱［24］。

2.5 毛细管电泳法（CE）

有学者采用10mmol／L硼酸缓冲溶液（pH 值为10.0），温度为32 ℃，分离电压为19kV，检测波长为205nm；同时检测人尿液中4种被分析物，约用1min，未发现基质干扰；检测限为0.5mg／L，线性范围2.0～30mg／L，相关系数大于0.996［25］。李春宇采用缓冲液为15 mmol／L 的磷酸盐缓冲液（磷酸调pH 值为6.5），运行电压25kV，柱温为25℃，检测波长为200nm；检测结果：克伦特罗线性范围为0.000 56～0.013 44mg／mL（r＝0.999 8），加样回收率（n＝6）为99.83%（RSD＝1.17% ）［26］。该法可快速、简便有效地检测猪肉中盐酸克伦特罗的含量。

3 其他分析方法

宋诗稳等以自制纳米CeO2修饰碳糊电极建立了微分脉冲伏安法对盐酸克伦特罗的测定；方法检出限为2.5×10－9mol／L，线性范围为5.0×10－9～6.0×10－6mol／L（r＝0.998 2，n＝7），加标回收率为96%～104%［27］。高锰酸钾在多聚磷酸条件下与甲醛产生化学发光，盐酸克伦特罗能大大增强该发光强度，ZHOU 等基于分子印记技术在线富集克伦特罗，通过流动注射化学发光检测其含量，检测限为3.0 × 10－10g／mL，线性范围为1.0 × 10－9～5.0×10－8g／mL，RSD≤5%（n＝3）［28］。胡玉斐建立起一种直接测定盐酸克伦特罗的流动注射化学发光分析法，检出限为1.2×10－8g／mL，但此法抗干扰能力弱，还需进一步确证［29］。

4 结 语

目前ELISA 是快速筛选检测动物肌肉、尿液、肝脏等样品中克伦特罗残留的方法之一，ELISA 方法操作简单、快速，通常用作大规模样品筛选，是目前较常用的现场检测手段；化学发光酶免疫分析方法，具有灵敏度高、特异性强、成本低、速度快、样品前处理简单和安全无污染等优点，非常适合快速检测；试纸条检测方法简便易行，但存在人为因素影响，易造成假阳性出现；GC－MS 和HPLC－MS－MS通常作为定量和确证方法，但操作复杂，且不能现场检测，是目前实验室常见的检测方法。

现常用的盐酸克伦特罗的检测方法各有优缺点，研究更快速、高效、检测限更低、操作简单、费用低廉的现场检测方法是今后的发展方向。

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