幼鼠膈肌损伤与漏斗胸发生的实验研究

严文静，吴学东，李俊*

（1.大理学院护理学院，云南大理671000；2.大理学院附属医院，云南大理671000）

幼鼠膈肌损伤与漏斗胸发生的实验研究

严文静1，吴学东2，李俊2*

（1.大理学院护理学院，云南大理671000；2.大理学院附属医院，云南大理671000）

目的：探讨幼鼠膈肌损伤后与漏斗胸（PE）发生的关系。方法：将40只SD大鼠分成2组，实验组造成人为膈肌损伤，对照组施以假手术，至鼠龄12周全部处死观察胸廓外观及膈肌组织学形态。结果：膈肌损伤后，动物PE发生率为38.89%（7/18），实验组动物PE的发生率与对照组比较，差异有统计学意义。膈肌损伤后组织愈合结果为肌纤维结构松散、部分肌组织萎缩，纤维结缔组织增生，瘢痕形成。结论：膈肌损伤后瘢痕愈合引起膈肌挛缩，挛缩的膈肌持续牵拉前胸壁，牵拉力量是导致大鼠PE发生的主要因素之一。

膈肌损伤；漏斗胸；实验研究；SD大鼠

漏斗胸（Pectus Excavatum，PE）是小儿最常见的前胸壁凹陷畸形，其病因和发病机制至今尚不清楚，有学者提出过前方膈肌纤维化病因假说〔1〕，但未见进一步的研究报告。膈肌通过收缩与舒张造成对胸壁的牵拉、改变胸廓内负压而完成呼吸运动，故探讨膈肌损伤对胸廓发育的影响将可能是阐明PE发生机制的途径。本研究通过手术造成幼年（Sprague Dawley SD）大鼠膈肌损伤，并对膈肌损伤后的组织愈合和术后动物前胸壁畸形（PE）的情况进行观察，以期阐释膈肌挛缩与生长发育期幼鼠PE发生的关系。

1 材料和方法

1.1 实验材料4周龄SD大鼠40只，许可证号：SCXK（滇）2005-0007。10%水合氯醛溶液，95%医用乙醇，莱卡石蜡切片机，泰克显微图像分析仪（TECHPanasonic SDⅡ型）。

1.2 动物分组及手术40只4周龄SD大鼠，随机分成实验组和对照组，每组各20只，实验组经手术造成膈肌损伤，对照组仅以假手术作为对照。实验组用10%水合氯醛溶液腹膜腔麻醉后右上腹沿肋缘斜行入路，找到右侧膈肌胸骨部及膈肌肋部大部分，用注射器穿刺膈肌并注射95%乙醇0.02 mL，以浆膜下注射为度，术中不能刺穿膈肌，并在注射部位以95%乙醇涂擦做为加强。对照组麻醉成功后，仅以右上腹斜切口进入腹腔后不进行任何干预后关腹。术后笼内饲养至鼠龄12周后全部处死。

1.3 取材和组织学研究术后观察记录胸廓外观变化，两组动物于鼠龄12周时全部处死，取膈肌胸骨部及右肋部组织作HE染色。在显微镜下与对照组比较观察膈肌肌细胞的组织学形态结构。

1.4 统计学分析方法前胸壁畸形发生率的比较采用χ2检验；统计学分析用SPSS17.0软件完成，以P< 0.05为检验有统计学意义。

2 结果

实验组20只大鼠实际获得观察18只，因在鼠龄满8周前共死亡2只，均因术后2周后发生膈疝，未发生PE。术后直至12周处死时生长状态良好，共出现PE7只。对照组无动物死亡，亦无PE发生。

2.1 PE的发生率膈肌损伤术后1周内大鼠前胸壁外观无明显变化；术后2周实验组有7只SD大鼠切口上方前胸壁出现轻度的PE；至鼠龄8周PE随周龄增加有所加重，而鼠龄8周后PE趋于稳定，见图1。在鼠龄12周处死时，7只大鼠PE外观未见好转及加重，其余动物未出现PE。对照组未发生PE。实验组PE发生率为38.89%，两组发生率经χ2检验，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

图1 右肋下胸廓不规则凹陷

表1 两组前胸壁外观观察结果

2.2 膈肌损伤后组织愈合情况膈肌损伤的大鼠（取材为术后2周因膈疝死亡的大鼠标本）术后第2周时，肉眼下膈肌组织的手术区域与肝脏膈面黏连，且肉芽组织增生，色鲜红，颗粒状，柔软湿润，膈肌不规则增厚，光镜下手术区域见新生肉芽组织增生，新生壁薄的毛细血管丰富及增生的成纤维细胞，并有聚集成团、深染的炎性细胞浸润；取材鼠龄12周的标本，膈肌组织手术区域与肝脏膈面严重黏连，不易分离，表面凹凸不平，局部呈收缩状态，颜色较周围正常组织苍白，肌肉质地稍硬，弹性较差。光镜下组织内几乎无血管，由大量的平行或交错分布的胶原纤维束组成，纤维束呈均质红染即玻璃样变，部分肌组织萎缩，肌纤维结构松散，走行紊乱，纤维结缔组织比例增多，见图2。对照组膈肌表面光滑，颜色粉红，柔软弹性好，光镜下纤维呈细长的圆柱状或棱柱状，排列致密、走行规则，见图3。解剖大鼠胸腔观察，膈肌组织手术区域与胸膜腔及腔内脏器均未发生黏连。

图2 肌萎缩横切面HEx100

图3 正常膈肌横切面HEx100

3 讨论

人类PE畸形约90%可在出生后1年内发现，随年龄增大而加重，畸形变得不对称〔2〕。典型表现为深吸气时有胸骨向脊椎方向凹陷的异常反应〔3〕。许多学者提出了多种病因假说或学说〔4-5〕，但PE的病因和发病机制至今仍未阐明〔6〕，因此严重制约了临床对PE本质的认识和防治措施的实施。绝大多数PE出现于出生之后一年内，这提示在从胎儿到新生儿的转变过程中，特别是肺呼吸功能的启动，气道、肺、呼吸肌和骨性胸廓的发育状况、各自功能的开始及它们之间工作的协调性等，都可能在PE的发生过程中起作用〔7〕。

3.1 膈肌挛缩后的病理生理改变骨骼肌纤维是高度分化的细胞，再生能力很弱。若遭受损伤纤维断裂肌膜被破坏，将不能再生而由结缔组织增生充填，形成疤痕修复。膈肌具有骨骼肌的生理结构及功能，可参考其他骨骼肌的挛缩机制，结合本实验膈肌挛缩后的病理改变，探讨可能发生的膈肌形态及功能改变。临床上有关骨骼肌挛缩的探讨，较多的有臀肌挛缩等疾病，基本病理变化为骨骼肌纤维化，肌纤维的退行性变性和肌纤维纤维化，瘢痕组织形成，导致机体外观改变及骨骼肌功能减退〔8〕，与本实验膈肌的组织学病理改变相似。王靖等〔9〕对本实验的PE幼鼠膈肌，通过SDS聚内烯酰胺凝胶电泳结合westem印迹分析，检测膈肌MyHC-Ⅱa的表达发现，膈肌肌凝蛋白重链MyHC-Ⅱa表达减少，提示在PE形成过程中发生了膈肌纤维结构和功能的改变。

3.2 SD大鼠PE的观察目前尚无SD大鼠PE的评判及分级标准，本实验通过测量大鼠胸廓前后径和横径，并参照人类评价胸廓形状的胸廓横径与前后径之比值进行观察发现，实验组动物胸廓有从桶状胸向扁平胸再向PE改变的趋势，这与文献〔10〕报道在小儿PE病例中扁平胸与漏斗胸并存，且年龄越大胸廓扁平程度越明显的结论一致。正常大鼠的胸廓为前后径大于横径的类似鸡胸状〔11〕，且为匍匐爬行状态，肋骨在长期重力作用下生长，较人类更不易发生前胸壁凹陷，本实验手术实施后，以自然方式笼养未采用限制性仰卧体位，仍有7只大鼠出现PE，这说明手术干预方式对PE的形成是有效的。

3.3 膈肌挛缩后漏斗胸形成的机制在幼鼠期有两方面的解剖生理因素，可能促进了PE的发生。一是初生时的呼吸运动主要靠膈肌的舒缩来实现，故膈肌的牵拉对胸廓的影响相对强大。二是肋软骨及胸骨处于生长发育期，前胸壁骨性组成以软骨结构为主，抗弯曲能力较弱〔11〕，脆弱的胸廓塑型尚未稳定。基于以上两个因素，损伤后的膈肌，因挛缩而增强了对前胸壁肋骨附着点牵拉的力量，在持久向后牵拉的作用下，胸骨旁下位肋骨向脊柱方向凹陷，胸廓重新塑型并固定，形成PE。吴学东〔12〕通过切断SD大鼠胸骨旁下位3对肋软骨，复制出PE动物模型，并认为PE成因与膈肌对前下胸壁的牵拉作用有关。在本实验中有38.89%的动物出现PE，而对照组未发生，提示挛缩的膈肌向后牵拉相应肋骨，能诱发生长发育期的幼鼠发生PE。同时，术后膈肌组织手术区域与邻近的肝脏膈面严重黏连后，加固膈肌的挛缩，膈肌呼吸运动被限制，也可能在PE的形成过程中起到一定的推动作用。

实验组大鼠8周龄前出现PE7例，生长至12周龄时PE畸形并无进展或消退，同时也未发现有新增畸形例数，结合大鼠生长发育规律分析，在8周龄后大鼠已从幼鼠过渡为成鼠，骨骼不再增粗增长，骨性胸廓基本固定，由此可推测，挛缩的膈肌持续牵拉而造成PE主要在8周龄前形成，8周龄可能是干预的分界点与关键点。

3.4 实验研究的拓展空间在本实验中并非所有实施膈肌损伤的大鼠都形成了PE，这提示PE不是由单一原因引起的单纯的疾病〔13〕，而是多种疾病共有的一个临床表现，因此仍然存在PE的众多病因假说（如膈肌中心腱短缩、部分前方膈肌纤维化、骨和肋软骨发育障碍、结缔组织异常等）〔14〕，目前还没有一种假说能完全解释PE的病因，但本实验认为只要这些疾病能使膈肌产生足以持续向后牵拉胸骨、肋骨的力量，就有发生PE的可能。这就使我们有了可拓展的研究空间，在下一步PE的病因学探讨中，应着眼于是什么原因或疾病导致膈肌肌力和方向的改变，以及从分子水平探究膈肌肌力是如何改变的。

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〔14〕冯杰雄，胡廷泽.漏斗胸病因学研究进展〔J〕.中华小儿外科杂志，2002，23（2）：172-173.

（责任编辑 李杨）

Experimental Study of the Pectus Excavatum after Diaphragm Injury in Juvenile Rats

YAN Wenjing1,WU Xuedong2,LI Jun2*
（1.College of Nursing,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China; 2.Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the relationship of diaphragmatic injury and pectus excavatum in rats.Methods:Forty SD rats were divided into 2 groups,intervene group received the operation of injury diaphragm,and the control group received the sham operation. At the age of 12 weeks,all rats were sacrificed for observations of the chest appearance and histology and morphology of diaphragm. Results:The incidence rate of the pectus excavatum in intervened SD rats was 38.89%（7/18）after diaphragm contracture. Compared to the control group,the incidence rates were different with statistic significance.The muscle fiber structure was loose and disordered;the muscular atrophy,hyperplasia of fibrous connective tissue and scar formation were found in diaphragm injure. Conclusion:Injuried diaphragm led to contracture after diaphragm cicatricle healing,the contracture of diaphragm created a continuous stretch power on anterior chest wall,the force may be one of the factors which induce pectus excavatum.

diaphragm injury;pectus excavatum;experimental research;SD rats

R332

A

1672-2345（2013）06-0027-04

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.06.008

2013-01-26

2013-03-31

严文静，讲师，主要从事儿科临床及儿童保健研究. *通信作者：李俊，副教授.