大别山7个采样地山核桃叶的POD同工酶分析

薛 波，丁之恩，李 茜，吕 萍，孙潇辉，张继刚，杨 松

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036）

山核桃Carya cathayensis属胡桃科山核桃属落叶乔木，较为耐阴，喜凉爽湿润气候和深厚肥沃土壤，是我国重要的食用干果和木本油料植物[1]。大别山山核桃主要分布于安徽省金寨县的天堂寨、关庙乡、吴家店、沙河乡、燕子河及霍山县等地方[2]。目前对大别山地区不同品种山核桃的研究，主要集中在其生态学特征方面[3-4]。随着近代育种技术的不断发展，植物研究正向着形态分类、地理分布、解剖学、细胞学、分子遗传学等研究方向发展。同工酶是基因和性状的连接物，具有明显的种属、组织和发育阶段的特异性，既是生理指标，又是可靠的遗传标志。同工酶技术，即采用凝胶电泳方法，将不同的同工酶酶带分离开来，经过染色形成酶带谱，是遗传育种、生长发育、物种起源等研究领域中的一种重要的研究工具，其分析结果也可用作鉴定生物基因型是否有差异的可靠指标[5]。舒英杰、周玉丽等人[6]在比较分析8份不结球芸薹属蔬菜种质的POD、SOD和EST同工酶的基础上对其进行了分类，分类结果与果实性状的分类结果基本一致，说明同工酶法是可利用的。叶庆生、文李等人[7]利用同工酶和SDS-PAGE技术对兰属5个种和2个变种的11个品种进行了分类研究，得出了生化水平与传统形态学的分类结果基本一致的观点。然而，采用同工酶法研究大别山山核桃品种类型的文章还较少。为了给大别山山核桃资源的保护和利用提供理论依据，文中采用聚丙烯酰胺垂直平板凝胶电泳技术，通过POD同工酶分析对大别山山核桃进行了分类鉴定，现将研究结果分析报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试样品为采自于安徽省大别山地区7个不同采样地的不同类型的山核桃鲜叶，其采集地与种类编号详见表1。将新鲜树叶剪下后迅速放入玻璃瓶中，再将玻璃瓶放入装有医用冰袋的保温瓶中，控制低温，然后带回实验室后置于4 ℃的冰箱中短暂保存以备用。

表1 山核桃鲜叶样品的采集地及其种类编号Table 1 The collecting areas and type number of fresh leaves in C. cathayensis

1.2 仪 器

微量（µL）进样器,上海佳安分析仪器公司；高速冷冻离心机，DYCZ-28A型电泳槽，DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；凝胶成像系统，上海欧翔科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

酶液制备：分别称取7种不同采样地的山核桃叶样各1 g，置于预先冷却的研钵中,加入5 mL样品提取液（含6 mmol/L的巯基乙醇、5 mmol/L 的EDTA 0.05 mmol/L ，pH值为7.4的Tis-HCL缓冲液），液氮研磨至匀浆。4 ℃条件下以12 000 r/min的转速离心15 min，将其上清液置于－20 ℃的冰箱中储存以备用[8]。

制胶及电泳：制胶所用的分离胶质量分数为7.5%，浓缩胶质量分数为4%。电极缓冲液为Tris-Gly系统（pH值为8.3），指示剂为溴酚蓝，点样量为20 µL，在4 ℃的冰箱中稳压电泳，开始的电压为100 V，当溴酚蓝进入分离胶与浓缩胶界面时，加压到200 V，待溴酚蓝指示剂到达分离胶末端1 cm处时结束电泳[9-11]。

染色：采用醋酸联苯胺染色法[12]。

聚类分析：对POD同工酶酶带进行辨认，利用DPS统计软件多元分析中的0-1程序对数据进行系统聚类分析，采用jaccard聚类距离和类平均法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 POD同工酶酶谱分析

大别山地区7个采样地的山核桃样叶的POD同工酶扫描图谱如图1所示。由电泳扫描图谱可见，整个酶谱共出现6条酶带，分别以P1、P2、P3、P4、P5、P6表示，其Rf值在0.310～0.550之间变化。酶带P4、P6的Rf值分别为0.380、0.550，这2条酶带在酶谱中出现的位点相同，并且条带清晰，这可能是大别山山核桃的特征谱带。

图1 大别山地区7个采样地的山核桃叶片的POD同工酶图谱Fig.1 POD isoenzyme pattern in C. cathayensis leaves from seven sample areas in Dabie Mountain

由图1可知，不同种类山核桃叶间酶带的数量、酶带的强弱和迁移距离都有一定的差异：①酶带数量不同，即Ⅰ号样叶有4条酶带，Ⅱ、Ⅳ号样叶都有3条酶带，Ⅴ、Ⅶ号样叶都有6条酶带，Ⅵ号样叶有5条酶带；②酶带的强弱不同，在P1位点上，Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ号样叶的酶带均是强带，而Ⅵ号样叶的酶带却是弱带；在P2位点上，Ⅴ、Ⅶ号样叶的酶带均是弱带；在P3位点上，Ⅴ、Ⅶ号样叶的酶带均是强带；在P4位点上，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ号样叶的酶带均是弱带，而Ⅴ、Ⅶ号的酶带均是强带；在P5位点上，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ号样叶的酶带均是弱带，而Ⅴ、Ⅶ号的酶带均为强带；在P6位点上，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ号样叶的酶带均为弱带，而Ⅴ、Ⅶ号的酶带均是强带；③酶带的特征性不同，在P1位点上，Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ号样叶均有酶带，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号样叶均无酶带；在P2和P3位点上，Ⅴ、Ⅶ号样叶均有酶带，而其他样叶均无酶带。

2.2 聚类分析

对大别山地区7个采样地的山核桃叶片的POD同工酶酶带的辨认结果见表2，表2 中分别用1和0记录条带的有与无，形成1/0矩阵，再应用DPS进行聚类分析，结果如图2所示。根据聚类分析结果可以明确如下两点：亲缘关系越近的种类，其遗传距离越接近0；而亲缘关系越远的种类，则遗传距离越接近1。从图2中可以看出，在遗传距离为0.4时，可将大别山地区7个采样地的山核桃分为5类：第1类为霍山县的山核桃品种；第2类为水竹坪和燕子河的山核桃品种；第3类为天堂寨和关庙乡的山核桃品种；第4类为吴家店的山核桃品种；第5类为沙河乡的山核桃品种。当遗传距离为0.6时，又可将其分为3类：第1类即霍山县、水竹坪和燕子河的山核桃品种；第2类即天堂寨、关庙乡和吴家店的山核桃品种；第3类即沙河乡的山核桃品种。

表2 大别山地区7个采样地的山核桃叶片的POD同工酶酶带Table 2 POD isoenzyme bands in C. cathayensis leaves from seven sample areas in Dabie Mountain

图2 大别山地区7个采样地的山核桃聚类树形图Fig.2 Cluster dendrogram of C. cathayensis from seven sample areas in Dabie Mountain

3 结论与讨论

对大别山地区7个采样地的山核桃叶片的过氧化物同工酶酶谱进行了分析，结果总共分离出28条酶带，不同采样地的山核桃叶片同工酶酶带数各为2～6条，迁移率Rf值在0.310～0.470之间变化。酶带P5、P6均为大别山山核桃的特征谱带。

聚类分析结果显示，分类标准不同对大别山地区7 个采样地的山核桃品种的分类结果则不同。分析中发现，当遗传距离为0.4时，可以将7 个采样地的山核桃品种分为5类；当遗传距离为0.6时，可以分为3 类。综合两种分类结果来看，霍山县、水竹坪和燕子河这3个采样地的山核桃品种的亲缘关系较近，天堂寨、关庙乡和吴家店3个采样地的山核桃品种的亲缘关系也很近，只有沙河乡与其他采样地的山核桃的亲缘关系较远。

同时，同工酶表现型变化较大，因为同工酶不可能在一个组织或一个种中稳定不变地表达，而要受到植物的阶段发育和系统发育的影响，从而使酶谱表现出假多型性。因此，在分析同工酶谱时，要注意植物的不同发育阶段，从而找出重演性好的酶谱带，特别是特征谱带。因此，要尽可能增加试验的重复次数，这样的试验才具有科学性。另外，酶谱分析作为一种表现除代表遗传背景外，还受生理、人为等因素的干扰，所以，只有将酶谱分析方法与形态学、细胞学等其他方法结合起来进行分析，才能更准确地揭示不同品种间的亲缘关系[14]。

参考文献：

[1]肖 斌,周根土.加快大别山山核桃发展的途径[J].经济林研究,2006,24(3):80－82.

[2]陈素传,肖 斌,肖东正.大别山山核桃调查初报[J].落叶果树,2008,(2):36－37.

[3]郭传友,黄坚钦,方炎明.山核桃研究综述及展望[J].经济林研究,2004,22(1):30－34.

[4]傅松玲,丁之恩,周根土,等.安徽山核桃适生条件及丰产栽培研究[J].经济林研究,2003,21(2):1－4．

[5]徐迎碧,周先锋,殷彪等.4种不同石榴品种同工酶分析[J].护林科技,2006,71(2):17－19.

[6]舒英杰,周玉丽,赵晓雪等.8份不结球芸薹属蔬菜种质的POD、SOD和EST同工酶比较分析[J].种子,2011,30(10):25－28.

[7]叶庆生,文 李,潘瑞炽.利用同工酶和SDS-PAGE技术对一些兰属品种的分析[J].热带亚热带植物学报,1999,7(4):337－341.

[8]李学强,李秀珍,王祥.5种樱桃属植物的POD、CAT和SOD同工酶分析[J].生物学通报,2010,45(2):46－49.

[9]胡能书,万贤国.同工酶技术及其应用[M].长沙:湖南科学技术出版社,1985:171－180.

[10]何忠效,张树政.电泳[M].第2版.北京:科学出版社,1999:286－287.

[11]郭薏君.蛋白质电泳实验技术[M].北京:科学出版社,1999.

[12]于家政,范 明.蛋向质技术手册[M].北京:科学出版社, 2000.