细胞生物学创新实验设计——精子细胞学分析

侯 元， 霍德胜， 刘永茂

(吉林大学白求恩医学院实验教学中心，吉林长春130021)

0 引言

实验教学是高等学校教学过程中的一个重要环节，是高等学校的生命线，也是培养学生实际操作能力的重要环节［1］。实验教学方法有多种，如:基础性实验和验证性实验，设计性实验，综合性实验和创新性实验。基础性实验和验证性实验主要侧重于对理论知识的理解和记忆，创新性实验是与验证性实验相对应的，具有探索性和创造性的实验，其出发点是充分发挥学生学习的积极性、主动性和创造性，激发学生对科学技术的兴趣，培养学生的创新精神和实践能力［2］。为此，我们结合临床将科研成果转化为实验教学项目，开展了创新型实验设计。

1 实验设计的目的方法和意义

目前，男性因素在不孕不育症病因中占很大比例，精液分析在诊断男性不育及辅助生殖方面有重要作用。精液分析主要包括精子形态、密度和活力［3］。

1.1 精子细胞形态学检测

精子形态是评价男性生育力的一个重要参数，资料表明正常精子形态(strict criteria)是体外受精主要预测参数，被认为是衡量男性生育力的较好指标［4］。

实验课上，教师首先提供给学生一种简单的检测方法，即瑞士-吉姆萨染色法:标本用生理盐水洗涤3次，离心、涂片、晾干，用95%乙醇固定10 min，瑞士-吉姆萨染液染色30～60 s;加等量磷酸盐染色5～8 min，流水冲洗后，置95%的乙醇中2～4 s，自然干燥后，用树胶封片，结果显示了精子的正常形态和异常形态。

通过实验操作，不但掌握了细胞染色技术，同时对观察到的各种细胞形态产生了极大的兴趣，引发了他们的好奇心，引导他们进一步的思考。比如，这些千奇百怪的异常形态是由什么因素造成的，有没有其他更好的检查方法。同学们主动查阅各种资料寻找答案，最终发现:目前，精子形态分类标准不统一，各国执行的统一精子形态评价标准受到质疑。并且多数对精子形态的分析，是在经典光学显微镜的油镜下观察，主观因素较大。一些参数无法检测，亦不可能对大量样本进行分析。现有报道用计算机辅助精液分析系统(CASA和ASMA)为精子形态、动态分析提供了便利，提高了实验准确性和客观性［5］。随后，学生走出教室，走进临床医院生殖医学中心，采用WLJY-9000型彩色精子形态检查系统人工修正方法分析精子形态。操作过程中精液凃片用改良巴氏染色。形态按系统设定程序分为11类，即形态正常精子、大头精子、小头精子、梨形头精子、锥形头精子、无定形头精子、空泡样头精子、双头精子、颈部和中段缺陷精子、尾部形态缺陷精子，和其他形态缺陷精子。为提高阅片准确性，同一份样本由两位检测人员进行精子形态分析。这一社会实践活动进一步激发了学生们科学研究的热情。

1.2 精子活率与活力测定

精子的成活率对于生育也是至关重要的。精子活率测定方法采用伊红-Y染色法，即取精子标本用伊红Y染色，装片，镜检，死精子呈红色，活精子不着色。计数200个精子，计算得出活精子百分数。

此实验在使学生掌握了细胞制片技术和显微镜使用方法的同时，进一步了解精子运动特征对生育能力的影响。

Hirano等认为，评估精子运动速度是预测受精率的有利参数。本实验采用国产WLJY-9000型伟力彩色精子质量检测系统，进行精子活力分析。测定参数主要包括，精子曲线速度(VCL)、直线速度(VSL)、平均路径速度(VAP)、直线性(LN)、前向性(STR)、摆动性(WOB)、头部侧摆幅度(ALH)、鞭打频率(BCF)、平均移动角度(MAD)。通过这个实验，引发学生深入思考，如精子的活力受哪些因素影响，精子的运动速度与精子形态有何关系，造成精子死亡因素有哪些。

带着一大堆的疑问学生们走进了图书馆。他们孜孜不倦的查阅文献资料，真正理解了细胞是生物体结构与功能的基本单位这个定义的内涵［6］。构成人体或其他高等动物体的细胞种类繁多、形态各异，这些细胞的形态与其功能往往相适应。善于运动的精子是由于它长了一根长长的鞭毛［7］。Katz等［8］认为精子头部几何形态异常是导致精子运动异常的主要原因。由于研究手段不同，也有不同结果报道，认为精子头部畸形引起其流体力学特性改变导致的运动性改变、尾部受损引起运动方式改变的可能性很小。一些外界因素共同作用于精子形态和动态，引起两者同时改变是导致精子形态和动态异常相伴产生的主要原因［5］。

学生们在教师的指导下继续探索，对这些问题有了进一步认识:精子DNA与体细胞结构不同。精子DNA损伤是造成精子畸形和运动速度、方向改变的根源。精子DNA损伤会影响受精、受精卵分裂和胚胎发育，最后导致不孕不育、流产死胎、胎儿、婴儿发育异常。造成精子损伤的因素很多，如药物、放射线、高温、生殖道炎症、环境毒素、高龄和生活方式［9］。有报道，吸烟者的精子DNA断裂显著增高，吸烟对精子核质量是有害的。精子DNA损伤发生率与精子密度、活动力、形态等参数有高度的负相关性。吸烟导致弱精子症和畸精子症，轻度吸烟对精子活力有影响，重度吸烟对精子形态有影响。吸烟男性的精子密度和形态低于不吸烟者，且吸烟对精子参数的影响有剂量依赖性［10］。长期大量吸烟对精子凋亡有明显影响［11］。原因是:香烟烟雾中的诱变物质，不仅可以造成体细胞遗传物质的损伤，还可以通过血-生殖腺屏障对生殖细胞或精子的发育造成影响。导致精子DNA断裂增加，精子畸形增多［12］。慢性酒精中毒能使正常形态精子数下降。原因是:慢性酒精中毒引起维生素A和锌的缺乏，进而精子上皮细胞发育不良，导致少精子症和无精子症［13］。桑拿浴或经常用温度较高的水淋浴及在桑拿房停留的时间过久，可导致精子生成减少，或出现死精子［14］。因为探讨的内容与日常生活密切相关，引发了学生的好奇心，调动了学习的积极性。

1.3 白细胞检测

检测精液中白细胞是否存在，是寻找不孕不育症病因手段之一。本实验联苯胺染色法:取精子细胞标本1滴，加入1滴联苯胺染液，混匀，于37℃放置20 min，镜检，白细胞染成褐色，其他细胞染成品红色。采用联苯胺染色方法，依据白细胞内源性过氧化物酶，而使过氧化物酶阳性白细胞染成棕色。在有过氧化氢存在时MPO分解H2O2，产生新生态氧，将联苯胺氧化成带酯式结构的有色化合物。此方法涉及了生物化学中酶和底物特异性结合的理论知识与无机化学中的氧化还原反应等知识点。

为什么有的样本中存在白细胞?这对精子的形态、活力和活率有何影响，其发生机制如何?学生们经过深入探讨得知:因为有炎症反应，才使白细胞增多。精子中增多的白细胞可以刺激人类精子产生活性氧(Reactive Orygen Species，ROS)，这种刺激可以通过细胞-细胞接触或白细胞产生的可溶性产物等多种途径介导。25%～40%的不育男性精液中存在高水平的ROS［9］。当过量ROS超过了抗氧化系统的清除能力和防御能力时，则导致精子DNA双链断裂，产生单链。且由于精子细胞膜中含有大量不饱和脂肪酸，因此理论上精子极易受到ROS的损害。精子DNA被破坏后，精子的形态、活力和活率也就发生了相应的变化。

1.4 精子冷冻与复苏

精子的细胞学分析实验，对标本的活性要求很高。因此掌握精子的冻存与复苏技术是非常必要的。

(1)冷冻。将精液与保护剂1∶1混匀后，装入布袋，放在液氮液面上20 cm处冷冻20 min，再浸入液氮。

(2)复苏。将冻存的标本从液氮中取出后直接放入37℃水浴中5 min即可。

这个实验让学生亲眼看到细胞经超低温冷冻后，仍能恢复原始状态。

2 仪器设备及试剂

(1)仪器。自动平衡离心机、液氮罐、恒温水浴、恒温培养箱、WLJY-9000型伟力彩色精子质量检测系统。

(2)试剂。伊红Y、联苯胺、甲醇、玫瑰红、双氧水、瑞氏染液、吉姆萨染液、乙醇、甘油等。

3 结果与讨论

本实验设计由观察精子的形态入手，进而分析了精子的活力与活率，以及引起它们发生改变的各种外界因素。挖掘了男性不育症的根源。通过对患者精子活力检查、精子细胞形态学检查、白细胞的检查;学生掌握了精子细胞的形态学的检测方法，熟悉了显微镜和离心机等简单设备的使用方法，了解了自动化仪器的检测方法。通过精子的冷冻与复苏，掌握了细胞保存的原理和方法。

本实验设计始终坚持基础与临床相结合的原则，使学生对探索医学科学的奥秘产生了浓厚的兴趣。增强了学生学习的主动性与自觉性，实验收到了良好的教学效果。

4 结语

精子细胞学分析这一创新实验体系，通过五届临床医学七年制和六届临床医学五年制的教学实践证明，其方法具有创新性、针对性、实用性和可行性。由于它来自临床科研成果的转化，与临床检验关系密切。因此能极大地调动学生学习的积极性，引发学习兴趣。培养学生的科研意识和创新思维。提高学生综合运用知识，分析问题解决问题的能力［15］。从而使学生站在科学领域的前沿来了解科学发展的动态。以便尽快地适应社会发展的需要。

［1］ 吴瑶庆，张福辰，黄胜君.一个创新型实验项目的设计［J］.实验技术与管理，2008，25(12):30-33.

［2］ 白广梅，王小逸.创新性实验教学的思考［J］.实验技术与管理，2008，25(2):128-129.

［3］ 禹 智，刘睿智.精子形态检测标准化研究进展［J］.中国妇幼保健，2010，25(19):2755.

［4］ 王洪亮，刘睿智，张红国，等.精子形态与精子活率的关系［J］.吉林大学学报(医学版)，2006，32(4):678-680.

［5］ 马玉涵，刘睿智，许宗革，等.精子形态与精子运动参数关系研究［J］.中华男科学，2006，12(7):590-593.

［6］ 余从年，胡继鹰.医学细胞生物学导论［M］.北京:科学出版社，2001.

［7］ 李 凡，刘永茂.基础医学实验教程［M］.北京:高等教育出版社，2002.

［8］ Katz D F，Diel L，Overstreet JW.Differenccs in the movement of morphologically normal and abno rmal human seminal spermatozoa［J］.Biolreprod，1982，26(4):566-570.

［9］ 戴汝琳，刘睿智.影响精子DNA损伤因素研究进展［J］.生殖与避孕，2009，29(6):385-388.

［10］ 刘俊茹，陈明强，文陶非，等.吸烟对精子DNA完整性、精子参数的影响［J］.Maternal and Child Health Care of China，2009，24(33):4717-4718.

［11］ 王光荣，周曾娣，葛争鸣.吸烟对精子凋亡的影响［J］.现代医院，2005，5(5):25-26.

［12］ 李义平，王 平，王亚文.香烟主流烟雾与侧流烟雾对小鼠致突变作用的研究［J］.中国公共卫生，2001，17(8):707-708.

［13］ 谷振环，刘睿智，孙 娇，等.吸烟饮酒与精子形态的相关性及双因素对精子形态影响［J］.现代预防医学，2007，34(14):2617-2619.

［14］ 郭 航，张红国，薛百功，等.吸烟、饮酒和桑拿对精子形态的影响［J］.中华男科学杂志，2006，12(3):215-217.

［15］ 袁广卿，周俊宣，骆晓枫，等.开放实验室探索创新性实验项目的实践［C］//第二届全国医学类实验教学研讨会(论文汇编)，2009:199.