山蜡梅叶中3种黄酮类成分含量动态变化研究

聂 韡，房海灵，黄丽莉，江香梅

(江西省林业科学院，江西 南昌 330032)

山蜡梅(Chimonanthus nitens Oliv.)为蜡梅科蜡梅属植物，又名秋蜡梅、毛山茶等，为江西原产植物，具有祛风解表、清热解毒、醒脾化浊之功效，可用于治疗上呼吸道感染、肺结核咯血等［1－2］。近年来，对山蜡梅叶的化学成分有少量报道［3－5］，研究表明其活性成分主要为黄酮及生物碱类成分。目前，由山蜡梅叶制成的制剂多以黄酮类成分作为其质量控制的标准［6－7］，而对山蜡梅叶药材并未有关于其黄酮类成分的质量标准的研究，本实验建立了以HPLC法同时测定芦丁、槲皮素和山奈酚3种黄酮类成分的方法，并对不同采收时间的山蜡梅叶的上述3种黄酮类成分的含量动态变化进行了研究分析，为确定山蜡梅叶最佳采收期提供理论依据，也可作为山蜡梅叶及其制剂的质量控制的标准。

1 仪器与材料

1.1 实验器材

Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司);紫外检测器;超声清洗器(洁康超声波有限公司);CP214型分析天平(奥豪斯仪器有限公司)。

芦丁、槲皮素和山奈酚标准品(纯度98%)，芦丁标准品批号:100080－200707，槲皮素标准品批号100081－200907;山奈酚标准品批号:110861－200507;均购自江西省药检所。甲醇(色谱纯，天津大茂公司);娃哈哈纯净水(杭州);其余试剂均为分析纯。

山蜡梅叶采自江西婺源，经江西省林业科学院朱培林研究员鉴定为蜡梅科(Calycanthaceae)山蜡梅(Chimonanthus nitens Oliv.)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为sunfire C184.6mm×250mm色谱柱;流动相为甲醇:水(含0.1%甲酸的溶液:0～5 min:30%～35%;5～30 min:35%～40%;30～38 min:40%～60%;38～48 min:60%～75%;48～60 min:75%;检测波长为360 nm;流速为1mL/min;柱温为25℃;进样量10μL。在该条件下，山蜡梅叶药材及对照品色谱图见图1。

图1 混合对照品和山蜡梅叶的HPLC色谱Fig.1 HPLC chromatorams of mixed reference substances and leaves of Chimonanthus nitens Oliv.

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取0.005 g芦丁、槲皮素和山奈酚标准品，用甲醇(色谱纯)溶解并定容至10mL，精密量取各标准品溶液1mL，混匀，制得混合标准品溶液，进样前用0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，去杂质，备用。

1.2.3 供试品溶液的制备 称取山蜡梅叶粉末1 g，精密称定，加入40倍φ乙醇=70%溶液，50℃超声提取30 min。提取液放置至室温，甲醇定容至100mL，摇匀后取上清液，0.45μm微孔滤膜滤过，待用。

1.2.4 样品的测定 按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取各供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，按“1.2.1”项下色谱条件进行分析，以外标法计算芦丁、槲皮素和山奈酚的含量。

2 结果

2.1 标准曲线的绘制

精确移取对照品混合溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6分别于1mL容量瓶中依次稀释定容，取上述各溶液10μL进样。按“1.2.1”项下色谱条件进行分析，以各自的峰面积积分值Y为纵坐标，进样量X(μg)为横坐标，绘制标准曲线，求得芦丁、槲皮素和山奈酚回归方程，分别为:Y=1×106X－40497，r=0.996;Y=3×106X－197608，r=0.9997;Y=4×106X－332890，r=0.9992。结果表明，芦丁、槲皮素和山奈酚分别为0.092～1.1 μg，0.088～1.06 μg，0.093～1.113 μg，线性关系良好。

2.2 精密度试验

精密吸取样品溶液10μL，连续重复进样6次，记录峰面积，测得芦丁、槲皮素和山奈酚含量的RSD分别为1.01%，0.78%，0.94%，表明仪器精密度良好。

2.3 重复性试验

按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样10μL，记录峰面积，测得芦丁、槲皮素和山奈酚含量的RSD分别为1.23%，1.58%，1.46%，表明该方法重现性良好。

2.4 稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别在0、6、12、18、24h测定，记录峰面积，测得芦丁、槲皮素和山奈酚含量的RSD分别为1.82%，2.03%，1.69%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的山蜡梅叶5份，每份为1 g，分别精密加入混合对照品溶液，吹干。然后按照“1.2.3”项下方法制得待测溶液，按“1.2.1”，项下方法进行分析，计算加样回收率。经计算，芦丁、槲皮素、山奈酚的平均加样回收率依次分别为98.64%、101.33%、97.89%，RSD值均小于2%，表明分析方法的准确度良好。

表1 不同采收时间山蜡梅叶中黄酮类成分含量测定结果Tab.1 Contents of flavonoids in leaves of Chimonanthus nitens Oliv.in different harvesting time

2.6 山蜡梅黄酮类成分含量动态变化

本试验采用HPLC法测定了不同采收时间的山蜡梅叶中3种黄酮类成分的含量，分别收集5月、6月、7月、8月、9月、10月的山蜡梅叶，测定其中芦丁、槲皮素和山奈酚3种黄酮类成分的含量(表1、图2)。数据显示，山蜡梅叶中上述3种黄酮类成分从5月份开始显著累积，推断可能首先生成黄酮苷元类成分槲皮素和山奈酚，经由黄酮苷元类成分继续合成黄酮苷类成分芦丁。槲皮素和山奈酚为两种黄酮苷元类化合物，在早期含量较高，5月份，芦丁、槲皮素、山奈酚三者含量接近，随着黄酮的生物合成途径继续进行，黄酮苷元类成分槲皮素、山奈酚增长至7月达到最高值，而后开始呈现下降趋势，分析原因为从7月开始，叶片趋于成熟，黄酮苷元停止合成，已生成的黄酮苷元类成分作为中间体继续生成黄酮苷类成分芦丁等，因此含量从7月份开始逐渐下降。黄酮苷类成分从5月开始呈现稳步上升，尤其在8月至10月期间，山蜡梅植株的营养成分已累积充分，黄酮苷类成分累积速度尤为明显。黄酮类成分总含量从5月份开始到7月份呈现逐渐递增趋势，7至8月份由于植株的营养成分在该期间大量累积，造成黄酮类成分合成速率略有降低，从8月至10月黄酮类成分继续加速增长。因此，从山蜡梅黄酮类成分累积的动态变化分析，为保证山蜡梅叶中各种黄酮类成分都较多，同时考虑药材产量的因素，选择8至9月份作为山蜡梅叶的最佳采收期较适宜。

3 讨论

3.1 提取方法的选择

通过对提取方法(热回流提取法、冷浸提取法、微波提取法、超声提取法)的考察，发现超声提取法的提取效率较高，且杂质少，故采用超声提取法。在此基础上采用正交试验L9(34)对超声提取法的提取工艺进行了优化，考察了料液比、提取时间和提取温度3因素的3个水平，测定结果表明，最佳提取方案为，结果发现用40倍φ乙醇=70%溶液于50℃超声提取30 min，可以使4种黄酮类成分均达到较高的提取效率。

3.2 色谱条件的优化

3种被测成分均属于黄酮类结构骨架，紫外扫描发现其紫外吸收带I在360 nm处有较大吸收，因此，选择检测波长360 nm进行测定。另外，在确定流动相系统时，分别比较了不同梯度的甲醇－水、乙腈－水、甲醇－甲酸水溶液、甲醇－磷酸水溶液、甲醇－三氟乙酸溶液等多个溶剂系统进行洗脱，经多次试验，最终确定了以甲醇－0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱，可使各待测组分得到很好的基线分离且0.1%的甲酸可有效地防止色谱峰的拖尾现象。

3.3 以往文献报道

测定山蜡梅叶中黄酮类成分的HPLC方法控制指标较少，多以槲皮素为指标［8］，不能较全面地评价山蜡梅叶及其制剂的质量。本试验建立的HPLC法可同时测定山蜡梅叶中的3种主要黄酮类成分，且具有分离度高、测定准确的特点，可以更加全面地控制和评价山蜡梅叶及其制剂的质量。

图2 不同采收时间山蜡梅叶中黄酮类成分含量变化Fig.2 Dynamic changes of flavonoids in leaves of Chimonanthus nitens in different harvesting time

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