不同温度大鼠无血预充深低温停循环模型的建立

朱 贤，陆 龙，赵向东，孙燕华，吴树彬，刘晋萍，吉冰洋，姚建民

·基础研究·

不同温度大鼠无血预充深低温停循环模型的建立

朱 贤，陆 龙，赵向东，孙燕华，吴树彬，刘晋萍，吉冰洋，姚建民

目的建立温度可控的大鼠深低温停循环（DHCA）完全脑缺血模型。方法23只SD大鼠分为五组。A组：DHCA 15～20℃（n＝5）；B组：DHCA 20～25℃（n＝5）；C组：DHCA 25～30℃（n＝5）；D组：常温体外循环组（n＝5）；E组：假手术组（n＝3）。七氟烷诱导麻醉，颈静脉置入自制多孔静脉引流管为静脉引流端，左侧股动脉22G套管针穿刺监测血压，鼠尾动脉20G套管针穿刺为动脉灌注端，转机过程中分别于6个时间点抽取血气，记录各时间点血气值及复跳时间。结果2只大鼠死亡，其余21只大鼠均顺利完成实验过程，DHCA各组心脏复跳后，乳酸值明显升高，血压、心率较D、E组降低。结论本实验模型可用于研究温度及其他干预条件下DHCA对大脑及其他脏器的影响。

深低温停循环；大鼠；模型

深低温停循环（deep hypothermic circulatory arrest，DHCA）技术的应用已有60多年的历史，目前常用于成人大血管外科以及部分小儿复杂先天性心脏病的畸形矫治，在临床上发挥着重要作用，然而，DHCA技术引起诸多并发症，尤其是神经系统并发症，长久以来困扰着临床工作者。

目前，针对深低温停循环DHCA的实验研究，仍然缺乏一个有效的动物模型。传统的大动物模型费用昂贵，需要耗费较大的人力物力，不适合大样本实验的开展。大鼠价格便宜，来源丰富，和人类同源性较好且具有丰富的基因和蛋白的检测手段，受到广大临床科研工作者的青睐［1］。本篇文章结合近年来国内外的相关研究，建立了一种改良的大鼠深低温停循环DHCA模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 本实验经中国医学科学院阜外心血管病医院动物伦理委员会批准。成年健康雄性SD大鼠23只，体重350～450 g（由中国医学科学院阜外心血管病医院动物中心提供），根据停循环温度的不同分为五组：A组：DHCA 15～20℃（n＝5）；B组：DHCA 20～25℃（n＝5）：C组：DHCA 25～30℃（n＝5）；D组：常温体外循环组（n＝5）；E组：假手术组（n＝3）。

1.2 体外循环管道［2］整体管道由回流室（5 ml注射器），硅胶管道（内径4 mm），小动物膜肺（东莞科威医疗用品有限公司，预充量＜4 ml），变温器（西京医疗用品有限公司，预充量＜3 ml），双头滚压泵（德国Stockert公司），变温水箱（Maquet Critical Care AB，Solna，Sweden）。管道预充液组成：11 ml胶体（6%羟乙基淀粉130/0.4，北京费森尤斯卡比医药有限公司），0.5 ml肝素（250 IU/ml，常州千红生化制药有限公司），维持回流室2～3 ml初始液面高度。

1.3 外科准备 随机选取实验大鼠，称重。七氟烷吸入诱导麻醉，四肢固定于操作台，置肛温。16G麻醉套管针经口气管内插管，接小动物呼吸机（Harvard Apparatus）行机械通气，吸入100%纯氧混合3%七氟烷维持麻醉，呼吸频率初始设定为60次/min，潮气量8～10 ml/kg（可根据血气值进行调节）。在外科显微镜（Oberkochen German）下进行尾动脉（20G套管针灌注用）、左侧股动脉（22G套管针监测用）穿刺置管，右侧颈静脉（22G静脉输液针硅胶管改制）用精细外科剪刀剪开，在动脉鞘管导丝引导下，经缺口送入静脉引流管，尖端至右房水平（前期实验中已明确颈静脉至右心房距离并做上标记）。所有置管血管远心端丝线结扎，近心端丝线固定置管，防止滑脱。静脉引流重力高度为35 cm。全身400 U/kg肝素化后，行持续血流动力学监测。

1.4 转流过程 体外循环管道预充排气，预充液为6%羟乙基淀粉130/0.4。所有靶血管置管完毕后，将静脉引流管置于回流室，开始体外循环，根据引流速度调整合适泵速，维持回流室液面平衡，以纯氧和二氧化碳混合气体进行氧合并根据实际血气值进行调节，尽可能维持pH值和二氧化碳分压（PCO2）的相对稳定。实验过程中若出现血压明显下降，则予以补充胶体，所有实验过程均不使用任何血管活性药物。转中动脉灌注流量为100～150 ml/（kg·min）。

转流过程分为五个阶段：①常温体外循环：维持15 min；②降温：利用变温水箱降至目标温度，时间限定为30 min；③停循环：降温完毕后停机，静脉端继续引流，取20 ml注射器自回流室吸取大鼠血液储存，直至血压成一条直线时夹闭静脉端，停循环维持30 min，期间出现温度上升时，给予体表均匀碎冰屑维持温度；④复温：将20 ml注射器中的血液重新注入回流室，静脉引流打开，开始体外循环，变温水箱复温，温差＜8℃，心脏复跳，直至温度达到33～34℃以上，复温时间为1 h；⑤停机：体温达到目标温度后停机，呼吸机维持30 min。

1.5 实验数据采集 分别于术前，降温前，停循环前，复温后20 min，停机前，停机后30 min六个时间点采集大鼠血流动力学指标和进行血气分析。

1.6 统计处理 应用SPSS 13.0软件进行处理和统计分析，数据用均数±标准差（¯±s）表示，对六个时间点数据进行单因素方差分析，各组数据之间应用LSD检验（Least significant Difference，最小显著差值法）；P＜0.05表明有统计学差异。

2 结 果

2.1 实验结果 各组大鼠体重均值无统计学差异。实验过程中共出现2只大鼠死亡，C组中1只大鼠复跳后出现无法控制的低血压后停止实验，开腹检查后发现不明原因的腹腔出血。D组中1只大鼠在转机开始10 min后突然出现血压下降，补充液体无明显效果后停止实验，开腹检查发现腹腔间隙渗液较多，考虑是由过敏反应引起的急性血压下降。其余21只大鼠均顺利停机。实验结束后开腹检查，A、B、C、D四组腹腔中均发现有不同程度的间隙渗出，D组渗出程度轻于A、B、C组。复跳时间，A组明显较B、C组延长（P＜0.05）。见表1。

2.2 血流动力学结果 见表2。血红蛋白（Hb）和红细胞比容（Hct）均可维持在目标值范围内，PaO2，PaCO2处于正常范围，但PaCO2波动较大。

平均动脉压（MAP）：降温前各组MAP无明显差异，降温复温期间，不同的温度对血压的影响较大。停机后30 min MAP D、E组高于A、B、C组（P＜0.05），前两组间无明显统计学差异（P＞0.05），A组术后血压高于B、C组（P＜0.05），后两组之间无明显差异（P＞0.05）。

心率（HR）：温度对心率的影响较大，停机后30 min心率B、C组比较于D、E组有所减慢（P＜0.05），其他组之间未见有明显统计学差异。

2.3 乳酸（Lac） 停循环前三个时间点，各组间Lac值无明显差异。复温后20 min，A、B、C三组Lac值明显高于D、E组（P＜0.05），A、B、C三

组间，A组＜B组＜C组（P＜0.05）；停机前，A、B、C三组Lac值明显高于D、E组（P＜0.05），A、B、C三组间，A组＜B、C组（P＜0.05），B、C组之间无统计学差异；停机后30 min，各组Lac数值均有下降趋势，而B、C组显著高于其他各组（P＜0.05）。

表1 各实验动物基线资料（±s）

表1 各实验动物基线资料（±s）

注：∗与B组和C组比较P＜0.05。

表2 实验过程中各时间点血气分析比较（±s）

表2 实验过程中各时间点血气分析比较（±s）

注：∗与D组和E组比较P＜0.05；＃A组与B组比较P＜0.05；△B组与C组比较P＜0.05。

3 讨 论

神经系统功能障碍是患者DHCA术后最常见的并发症之一，有数据表明，体外循环或DHCA术后，短暂的神经功能障碍发生率为5.8%～28.1%，而不可逆的神经功能损伤达到1.8%～13.6%［3］。低温作为DHCA过程中神经系统保护的重要措施之一，一直备受争议。低温可以降低大脑的代谢率，减少兴奋性递质谷氨酸盐的释放［4］，最近的研究表明，低温可能通过诱导某些蛋白质的表达发挥主动保护作用［5］，另一方面，低温可以引起凝血机制障碍，氧解离曲线左移，心肌收缩功能障碍等一系列并发症，并且增加临床输血量［6］。如何选择一个合适的温度，既可以保护神经系统免受缺血缺氧损伤，又可以减少低温相关的并发症，是一个值得思考的问题。

建立简便易行的大鼠模型对深低温停循环过程进行研究一直是研究人员关注的热点。近年来，国内外均有报道成功建立大鼠深低温停循环模型，国内一些文章报道采用夹闭颈动脉的方法达到脑缺血的效果［7-8］。2011年，Waterbury T等报道了大鼠无血预充的深低温停循环模型的建立，通过降温至18℃以下，模拟临床停循环过程［9］。本课题组对大鼠深低温停循环模型进行了一定程度的改进，并取得了良好的效果。

3.1 模型建立方法

3.1.1 停循环方式 大鼠脑组织主要由椎动脉和颈总动脉供血，夹闭颈动脉仅能使大脑处于一个相对缺血的状态，而椎动脉仍然可以对大脑的部分区域进行供血。临床上DHCA过程中，大脑基本处于无血状态，并非单纯的缺血过程，夹闭颈动脉并不能完全模拟DHCA过程。另有采用单纯降温的方式使心脏停跳［9］，本实验研究过程中发现，当大鼠体温降至18℃以下时，大鼠的血压仍有明显的波形，心脏仍有微弱的跳动，单纯采用降温的方法无法使心脏按照既定的温度要求停跳。综合考虑多方面因素，本实验采用了将大鼠全身血液引空的方式使心脏停跳，模拟大鼠脑组织完全缺血的状态，其优点在于：①更贴近临床过程；②可以在任意温度下模拟DHCA过程，研究不同温度下各器官的病理生理过程。

3.1.2 温度调控方式 实验中的温度控制装置采用临床变温水箱和动物变温器。目前大多文献中报道的降温复温方式各不相同，然而，大部分均存在温度控制不精确、效率不高等缺点。本实验首次将临床变温水箱应用于实验，增加的管道预充量不会对实验产生较大的影响，亦可以模拟临床精确的控制大鼠体温。

3.1.3 部分实验方法的选择 实验过程采用滚压泵，气体麻醉，无血预充，更好的模拟了临床过程，动脉插管采用尾动脉，避免了过去股动脉插管损伤大动脉的缺点。静脉插管采用自制的静脉采血针硅胶管，成功率高，取得了良好的效果。

3.2 实验数据分析 从数据结果来看，相比较于常温体外循环组和假手术组，30 min的停循环过程造成了DHCA组大鼠体内大量无氧代谢产物Lac的堆积，温度越低，Lac数值越低，这从一个侧面反应了低温可以通过降低能量的消耗来达到机体的保护作用。除2只死亡大鼠，各DHCA组的大鼠心脏均成功复跳，复跳时间与停循环温度相关，B、C组停机后心率较其他组有所减慢，考虑可能由于在温度较高的条件下，缺血对心肌功能的影响较大。术中恢复血流供应后，各DHCA组均出现组织间隙渗出，停机后各组大鼠血压均可平稳维持，但是DHCA各组血压相对较低，这可能与大鼠体内血管扩张，血管壁通透性增加相关。

3.3 实验中存在的不足 本实验中先后使用纯氧和空氧混合气体作为膜肺的氧合气体，但是大鼠在实验过程中出现了PaCO2下降，pH升高的呼吸性碱中毒表现，随后改用二氧化碳压力钢瓶，利用二氧化碳和纯氧的混合气体对静脉血进行氧合，可以根据转中大鼠的血气值调节PCO2和PO2在合适的范围。但二氧化碳压力钢瓶无法恒定维持CO2的流量，从而造成转中PCO2数值标准差增大。

总的来说，本实验成功建立大鼠DHCA模型，和以往的模型相比，该模型使大脑处于完全缺血的状态，并且温度调控精确方便，对于研究不同温度以及其他干预因素下DHCA对各脏器的影响有着积极的意义。

［1］ Ballaux PK，Gourlay T，Ratnatunga CP，et al.A literature review of cardiopulmonary bypass models for rats［J］.Perfusion，1999，14（6）：411-417.

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［8］ 陶运明，莫绪明，谷兴琳，等.深低温停循环脑保护大鼠模型的建立［J］.江苏医药，2005，31（7）：536-537.

［9］ Waterbury T，Clark TJ，Niles S，et al.Rat model of cardiopulmonary bypass for deep hypothermic circulatory arrest［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2011，141（6）：1549-1551.

Establishment of a temperature-controlled deep hypothermic circulatory arrest model without blood priming in rats

Zhu Xian，Lu Long，Zhao Xiang-dong，Sun Yan-hua，Wu Shu-bin，Liu Jin-ping，Ji Bing-yang，Yao Jian-min
Anhui Medical University，Anhui Hefei 230032，China；Departmen of Cardiopulmonary Center，the Military General Hospital of Beijing，Beijing 100700，China

Ji Bing-yang，Email：dr.ji.cpb＠gmail.com Yao Jian-min，Email：jimyao＠vip.sina.com

ObjectiveTo establish a temperature-controlled deep hypothermic circulatory arrest（DHCA）model in rats with complete ischemic brain.MethodsTwenty three rats were divided into 5 groups，A：DHCA group 15℃-20℃（n＝5）；B：DHCA group 20℃-25℃（n＝5）；C：DHCA group 25℃-30℃（n＝5）；D：normthemic CPB group（n＝5）；E：sham group（n＝3）.After sevoflurane inhalation anesthesia，homemade multiorificed catheter was cannulated in right jugular vein for venous drainage.22G catheter was cannulated in left femoral artery for monitoring arterial blood pressure，20G catheter was cannulated in tail artery for the arterial inflow.Blood gas，homodynamic parameters，interval of cardiac recorvery were measured in six time points before the end of the process.ResultsTwenty one rats survived during the experiment，while two died.After heart resuscitation，comparing to D，E group，lactate of rats in three DHCA groups significantly increased，heart rate and blood pressure declined.ConclusionThe model could be used to study pathophysiology of brain and other organs caused by DHCA in different temperature and other interventions.

Deep hypothermic circulatory arrest；Rat；Model

R654.1

A

1672-1403（2013）02-0107-05

2013-04-09）

2013-04-10）

230022合肥，安徽医科大学（朱 贤）；100700北京，北京军区总医院心肺一区（朱 贤、陆 龙、赵向东、姚建民）；100037北京，中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外心血管病医院体外循环科（孙燕华、吴树彬、刘晋萍、吉冰洋）

吉冰洋，Email：dr.ji.cpb＠gmail.com

姚建民，Email：jimyao＠vip.sina.com