MicroRNAs 在调控蜜蜂个体发育、级型分化和劳动分工中的功能研究

牛德芳，陈 璇，胡福良

(浙江大学动物科学学院，杭州 310058)

microRNAs(miRNAs)是一类长度为19～24 nt的非编码单链RNA，由长度约70～90 nt 具有茎环结构的单链RNA 前体(pre-miRNA)经Dicer 酶加工生成。miRNAs 靶向一个或多个目标基因的3'端非编码区，通过抑制mRNA 翻译或降解mRNA，在转录后水平调控基因的表达(Lau et al.，2001;Kim，2005)。miRNAs 广泛存在于动植物以及病毒中，参与细胞分化、细胞增殖与凋亡、胚胎和组织分化、激素分泌、免疫应答等过程，并与癌症和其他疾病的发生有关(Bartel，2004;Chen et al.，2008)。

昆虫miRNAs 的研究较少，主要集中在果蝇Drosophila melanogaster Meigen 上。研究发现miRNAs 参与调控果蝇的细胞凋亡、细胞分裂、Notch 信号通路、神经发育、卵子发生等生物学过程(Lai et al.，2005;Leaman et al.，2005;Nakahara et al.，2005)。随着越来越多昆虫全基因组测序的完成，在全基因组水平上鉴别新的miRNAs 及其功能得到了快速发展。蜜蜂Apis 作为典型的社会性昆虫，被广泛认为是研究社会行为机制和进化的模式生物(Robinson et al.，2005;郑火青和胡福良，2009)。因此，研究蜜蜂miRNAs 的种类及其在蜜蜂个体发育、级型分化、社会性行为等方面的调控作用，对了解miRNAs 的进化过程以及它们对昆虫生物学功能的影响有着重要的借鉴意义。

1 蜜蜂miRNAs 全基因组水平的挖掘

1993年，Lee 等在线虫Caenorhabditis elegans Maupas 中首次发现miRNA——lin-4，之后在动物、植物和病毒中发现了许多不同的miRNAs 基因。目前，最新 miRBase19.0 版本数据库中(http://www.mirbase.org/)收录的成熟miRNAs增至25141 条，共涵盖193个物种。2006年西方蜜蜂A.mellifera 基因组测序的完成，为蜜蜂miRNAs 的识别和功能研究奠定了基础。Weaver 等(2007)首先运用3种独立的计算方法识别了蜜蜂全基因组中65个miRNAs 候选基因，其中包括与果蝇同源或是果蝇中没有识别的miRNAs。他们推测这些miRNAs 可能参与了蜜蜂的发育，特别是参与调控蜂王和工蜂发育途径的转变。

随着深度测序技术的发展，尽可能全面地挖掘蜜蜂miRNAs 成为可能。Chen 等(2010)利用高通量测序技术挖掘蜜蜂三型蜂(蜂王、工蜂、雄蜂)不同发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)的miRNAs 及其表达情况，预测获得了267个新的候选miRNAs(其中110个被miRBase 数据库收录)，81个新的miRNAs 在其他昆虫中有直系同源基因，说明它们可能有类似的功能。该研究不仅丰富了蜜蜂miRNAs 的种类和数量，也为探索miRNAs 在蜜蜂生物学过程中的调控功能奠定了基础，甚至为其他昆虫或物种miRNAs 的识别提供参考。

2 蜜蜂miRNAs 的特异性/偏好性表达

miRNAs 的表达具有阶段、组织、级型和性别差 异 性(Babak et al.，2004;Mishima et al.，2008)。例如，一些哺乳动物大脑偏好性表达的miRNAs 参与神经元分化、突触可塑性和行为调控等功能(Smirnova et al.，2005;Schratt et al.，2006;Wayman et al.，2008)。为了解蜜蜂miRNAs 的表达特性，Weaver 等(2007)对预测的65个miRNAs 进行检验，大部分已被证实至少在蜜蜂的一个组织中表达，其中ame-mir-9a、C3345和C5152 在工蜂腹部高表达，C1504和ame-mir-71 在蜂王腹部高表达，而ame-mir-71 在蜜蜂蛹期的表达高于成虫期。Hori 等(2011)研究了ame-mir-276和ame-mir-1000 在成年蜜蜂脑部的表达情况发现，ame-mir-276和ame-mir-1000 分别在工蜂和雄蜂大脑中以大脑-特异性和-偏好性的方式表达。特别是ame-mir-276在哺育蜂、采集蜂、蜂王和雄蜂大脑的蘑菇体的视叶和小型-Kenyon 细胞中富集表达;ame-mir-1000和ame-mir-276 几乎所有的预测靶标都编码神经功能相关的基因，说明这两个miRNAs 都参与神经功能调节(Hori et al.，2011)。

3 蜜蜂级型分化相关miRNAs 的研究

蜜蜂作为典型的社会性昆虫，最重要的特征就是级型分化(Michener and Brothers，1974;郑火青等，2010)。雌性个体分化为蜂王和工蜂两个级型，蜂王专司产卵，工蜂从事除产卵以外的巢内外所有工作(Winston，1987;Robinson et al.，1997)。雌性蜜蜂级型分化是一个典型的表观遗传现象(Maleszka，2008;Chittka and Chittka，2010)。表观遗传学涉及的机制主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰和miRNAs(Allis et al.，2007;Chuang and Jones，2007)。因此，不难推测miRNAs 在蜜蜂级型分化中发挥了重要的作用。

Weaver 等(2007)发现miRNAs 在蜂王和工蜂腹部显示出不同的表达水平，并推测与它们生殖力不同造成的腹部生理相差甚远有关系。为了探索蜜蜂级型分化关键时期(幼虫阶段)差异表达的miRNAs，陈璇等(2012)利用高通量测序系统检测了4、5日龄蜂王幼虫和工蜂幼虫中表达的miRNAs，从中分别识别出92、96、91和95个已知的蜜蜂miRNAs，并预测得到35、61、74和111个新的蜜蜂miRNAs。同时预测差异表达显著miRNAs 的靶基因发现，ame-mir-14、ame-mir-2796、ame-mir-34和ame-mir-317、ame-mir-375 可能分别参与调控蜂王和工蜂免疫调节、神经元的发育和分化、大脑功能相关发育和分化、消化系统发育等过程。

4 蜜蜂行为相关的miRNAs 研究

工蜂具有与日龄相关的完整劳动分工体系，即成年蜂在幼龄时主要从事巢内的哺育工作，到了2～3 周后，开始从事外出采集活动。研究证实这一行为的转变与蜜蜂脑部化学物质、脑部结构、激素分泌和基因表达等因素有关(Robinson，2002)。miRNAs 与蜜蜂行为转变关系的研究最先是Behura 等(2010)开展的，他们采用qRT-PCR 的方法研究了20个预测的miRNAs 基因在幼龄哺育蜂和老龄采集蜂脑部的表达，发现miRNA-124、miRNA-14、miRNA-276、miRNA-13b、let-7和miRNA-13a 在哺育蜂中高表达;miRNA-12、miRNA-9、miRNA-219、miRNA-210、miRNA-263、miRNA-92和miRNA-283 在采集蜂中高表达，说明蜜蜂miRNAs 的表达不仅具有阶段特异性，而且差异表达的miRNAs 可能参与了蜜蜂日龄相关的行为改变。

鉴于之前研究的大部分与蜜蜂行为相关的miRNAs 是预测序列，而不是实验上证实的，特别是miRNAs 前体序列形成成熟的miRNAs 还需要经历非常复杂的加工过程，可能与成熟miRNAs 的表达模式是不同的(Kim，2005)。Greenberg 等(2012)和Liu 等(2012)分别利用高通量测序的方法比较了内勤蜂和采集蜂大脑中miRNAs 的表达差异。Greenberg 等(2012)获得97个在工蜂头部表达的miRNAs，包括17个新的miRNAs，其中，5个高表达的miRNAs 中，ame-miR-184和ame-miR-2796 在采集蜂头部表达水平高于哺育蜂;ame-miR-1和ame-miR-275 在哺育蜂头部表达水平高于采集蜂;Bantam 在哺育蜂和采集蜂头部表达水平接近。研究还发现，在哺育蜂和采集蜂头部表达量最高，且在大脑中的表达水平高于头部腺体和头部其他组织的ame-mir-2796 很可能是通过协同增强宿主基因(PLC)-epsilon 的作用，而参与蜜蜂神经元的发育和分化，从而调控蜜蜂的劳动分工(Greenberg et al.，2012)。Liu 等(2012)比较哺育蜂和采集蜂头部miRNAs 的表达，发现9个已知蜜蜂miRNAs 表达差异显著，其中ame-miR-31a、ame-let-7、ame-miR-279和ame-miR-275 在哺育蜂的表达水平高于采集蜂，ame-miR-13b、ame-miR-133、ame-miR-210、ame-miR-278和ame-miR-92a 在采集蜂中的表达水平高于哺育蜂。此外，他们还识别出67个新的蜜蜂miRNAs。Li 等(2012)利用同样的方法分析采集蜂和舞蹈蜂miRNAs 的表达情况，结果发现54个已知miRNAs 在二者中共同表达，其中32个miRNAs 在舞蹈蜂中显著下调，ame-miR-34，ame-miR-210，ame-miR-278和ame-miR-282 差异最大。此外，在采集蜂和舞蹈蜂中分别预测到86个和104个新的miRNAs。利用qRT-PCR 进行验证，证实ame-miR-278和ame-miR-282 在舞蹈蜂中表达显著下调，并且两者对应的靶基因与激酶、神经功能、突触结合蛋白和能量代谢有关(Li et al.，2012)。该研究表明，miRNAs 参与调控蜜蜂的采集和舞蹈行为，并发挥重要功能。

5 结 语

蜜蜂miRNAs 的表达具有级型、阶段和组织特异性，探索这些差异或是特异性表达的miRNAs 不仅丰富了miRNAs 的种类和数量，也为探索miRNAs 在蜜蜂发育阶段或是整个生命周期中的调控功能提供了基础。此外，miRNAs 作为基因表达调节子在社会多样性中起作用，识别蜜蜂行为转变相关的miRNAs 有助于阐明社会生活相关基因的调控机制，也有利于蜜蜂在社会行为学、神经生物学、行为遗传学和免疫学等领域中发挥其模型作用。

References)

Allis C，Jenuwein T，Reinberg D，2007.Epigenetics.Caparros ML，ed.NY:Cold Spring Harbor Press.

Babak T，Zhang W，Morris Q，Blencowe BJ，Hughes TR，2004.Probing microRNAs with microarrays: tissue specificity and functional inference，RNA，10:1813-1819.

Bartel DP，2004.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function.Cell，116:281-297.

Behura S，Whitfield C，2010.Correlated expression patterns of microRNA genes with age-dependent behavioural changes in honeybee.Insect Mol.Biol.，19(4):431-439.

Chen X，Ba Y，Ma L，Cai X，Yin Y，Wang K，Guo J，Zhang Y，Chen J，Guo X，Li Q，Li X，Wang W，Zhang Y，Wang J，Jiang X，Xiang Y，Xu C，Zheng P，Zhang J，Li R，Zhang H，Shang X，Gong T，Ning G，Wang J，Zen K，Zhang J，Zhang CY，2008.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell Res.，18:997-1006.

Chen X，Yu X，Cai Y，Zheng H，Yu D，Liu G，Zhou Q，Hu S，Hu F，2010.Next-generation small RNA sequencing for microRNAs profiling in the honey bee Apis mellifera.Insect Mol.Bio.，19(6):799-805.

Chen X，2012.Genome-wide identification of microRNAs and their regulation of transcriptome on female caste determination of honey bee(Apis mellifera).PhD thesis.Hangzhou:Zhejiang University.［陈璇，2012.蜜蜂(Apis mellifera)microRNA 的全基因组挖掘及在雌性蜜蜂级型分化关键时期转录组水平调控作用.博士学位论文.杭州:浙江大学］

Chittka A，Chittka L，2010.Epigenetics of Royalty.PLoS Biol.，8(11):e1000532.

Chuang JC，Jones PA，2007.Epigenetics and microRNAs.Pediatr.Res.，61(5，Part 2):24R.

Greenberg J，Xia J，Zhou X，Thatcher S，Gu X，Ament S，Newman T，Green P，Zhang W，Robinson G，2012.Behavioral plasticity in honey bees is associated with differences in brain microRNA transcriptome.Genes，Brain and Behavior，11(6):660-670.

Hori S，Kaneko K，Saito TH，Takeuchi H，Kubo T，2011.Expression of two microRNAs，ame-mir-276 and-1000，in the adult honeybee(Apis mellifera)brain.Apidologie，42(1):89-102.

Kim VN，2005.MicroRNA biogenesis:coordinated cropping and dicing.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，6:376-385.

Lai EC，Tam B，Rubin GM，2005.Pervasive regulation of Drosophila Notch target genes by GY-box-，Brd-box-，and K-box-class microRNAs.Genes Dev.，19:1067-1080.

Lau NC，Lim LP，Weinstein EG，Bartel DP，2001.An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.Science，294(5543):858-862.

Leaman D，Chen PY，Fak J，Yalcin A，Pearce M，Unnerstall U，Marks DS，Sander C，Tuschl T，Gaul U，2005.Antisense-mediated depletion reveals essential and specific functions of microRNAs in Drosophila development.Cell，121:1097-1108.

Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V，1993.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.Cell，75(5):843-854.

Li L，Liu F，Li WF，Li ZG，Pan J，Yan LM，Zhang SW，Huang ZY，Su SK，2012.Differences in microRNAs and their expressions between foraging and dancing honey bees，Apis mellifera L.J.Insect Physiol.，58:1438-1443.

Liu F，Pen WJ，Li ZG，Li WF，Li L，Pan J，Zhang SW，Miao YG，Su SK，2012.Next-generation small RNA sequencing for microRNAs profiling in Apis mellifera:comparison between nurses and foragers.Insect Mol.Biol.，21(3):297-303.

Maleszka R，2008.Epigenetic integration of environmental and genomic signals in honey bees.Epigenetics，3(4):188-192.

Michener CD，Brothers DJ，1974.Were workers of eusocial Hymenoptera initially altruistic or oppressed?Proc.Nat.Acad.Sci.，71(3):671-674.

Mishima T，Takizaw T，Luo SS，Ishibashi O，Kawahigashi Y，Mizuguchi Y，Ishikawa T，Mori M，Kanda T，Goto T，Takizawa T，2008.MicroRNA(microRNA) cloning analysis reveals sex differences in microRNA expression profiles between adult mouse testis and ovary.Reproduction，136:811-822.

Nakahara K，Kim K，Sciulli C，Dowd SR，Minden JS，Carthew RW，2005.Targets of microRNA regulation in the Drosophila oocyte proteome.Proc.Natl.Acad.Sci.，102:12023-12028.

Robinson GE，Fahrbach SE，Winston ML，1997.Insect societies and the molecular biology of social behavior，Bioessays，19:1099-1108.

Robinson GE，2002.Genomics and integrative analyses of division of labor in honeybee colonies.The American naturalist，160:S160-S172.

Robinson GE，Grozinger CM，Whitfield CW，2005.Sociogenomics:social life in molecular terms.Nat.Rev.Genet.，6:257-270.

Schratt GM，Tuebing F，Nigh EA，Kane CG，Sabatini ME，Kiebler M，Greenberg ME，2006.A brain-specific microRNA regulates dendritic spine development，Nature，439:283-289.

Smirnova L，Gräfe A，Seiler A，Schumacher S，Nitsch R，Wulczyn FG，2005.Regulation of microRNA expression during neural cell specification.Eur.J.Neurosci.，21:1469-1477.

Wayman GA，Davare M，Ando H，Fortin D，Varlamova O，Cheng HY，Marks D，Obrietan K，Soderling TR，Goodman RH，Impey S，2008.An activity-regulated microRNA controls dendritic plasticity by down-regulating.Proc.Natl.Acad.Sci.，105:9093-9098.

Weaver DB，Anzola JM，Evans JD，Reid JG，Reese JT，Childs KL，Zdobnov EM，Samanta MP，Miller J，Elsik CG，2007.Computational and transcriptional evidence for microRNAs in the honey bee genome.Genome Biol.，8(6):R97.

Winston ML，1987.The biology of the honey bee.Cambridge，MA:Harvard University Press.181-213.

Zheng HQ，HU FL，2009.Honeybee:a newly emerged model organism.Acta Entomologica Sinica，52(2):210-215.［郑火青，胡福良，2009.蜜蜂—新兴的模式生物.昆虫学报，52(2):210-215］

Zheng HQ，Zhao HX，HU FL，2010.Formation and maintenance of honeybee reproductive division of labor system.Chinese Bulletin of Entomology，47(6):1066-1071.［郑火青，赵慧霞，胡福良，2010.蜜蜂群内生殖分工体系的形成及其维持.昆虫知识，47(6):1066-1071］