乳腺癌循环肿瘤细胞临床应用的研究进展

李阳 刘巍

循环肿瘤细胞(CTCs)起源于原发肿瘤或转移灶，存在于肿瘤患者外周血中，虽然其在外周血中所占比例很小［1］。研究发现检测CTCs不仅能反映肿瘤负荷，还能预测复发和死亡风险，多种肿瘤中CTCs阳性者生存率明显低于阴性者，在治疗期间定期检测并监测CTCs的变化，可为评价治疗方案的敏感性提供依据，并且可以作为靶向治疗的靶标，有利于开展个体化的治疗［1］。越来越多的医学工作者开始关注CTCs，本文就相关研究进行综述。

1 CTCs

1869年，Ashworth在1例癌症死亡患者的外周血中发现了相似肿瘤的细胞，并提出了CTCs的概念［2］。目前的肿瘤转移理论认为，随着肿瘤细胞不断增殖，部分肿瘤细胞失去相互黏附的能力，从肿瘤母体脱离，浸润周围组织，甚至进入到血液或淋巴系统中。肿瘤细胞脱落、侵袭并进入血液循环是肿瘤转移的最初阶段，并为形成肿瘤转移病灶提供了可能，因此在外周血中检测循CTCs具有重要的临床应用价值。CTCs的检测有助于早期转移肿瘤患者的诊断、监测术后患者肿瘤的复发与转移、评估抗肿瘤药物敏感性、患者预后［3］以及选择个体化的治疗策略。

2 CTCs检测方法

CTCs在外周血中所占比例很小［4］。现有针对 CTCs的检测技术主要包括细胞富集和鉴定两个阶段。细胞富集主要用物理、化学原理，细胞鉴定主要依靠肿瘤细胞存在的肿瘤特异性或器官特异性标记以及肿瘤细胞本身的形态学特征等。选择两个阶段的不同方法并加以有效结合，最终寻找出敏感度和特异性较高的简便、精确的方法。

2.1 细胞筛选/富集技术 富集方法通常是CTCs物理性质(密度和大小)或免疫磁性的分选，常用的细胞富集技术主要包括密度梯度离心法、过滤法、免疫磁性分选技术(Immunomagnetic Separation，IMS)。因ISM利用免疫磁珠结合活性蛋白质和被磁铁所吸引的特性，依靠被分离细胞上抗原与包被磁珠的抗体的特异性反应形成抗原—抗体、磁珠免疫复合物。借助外加磁场完成对CTCs的筛选/富集。这类技术最大的优势在于分选过程避免了细胞裂解，但需借助细胞表面特异性标记物作为筛选的靶标，所以靶标的表达状况会影响分析方法的敏感性和特异性，且缺乏标准步骤及反应试剂等［5］。

2.2 肿瘤细胞鉴定技术 常用的鉴定检测技术包括逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学技术(Immunocytochemistry，ICC)、荧光原位杂交技术(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)和流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)等。RT-PCR是目前检测CTCs比较有效的方法，具有高效、高敏感、高特异性等优点。但由于测定过程需破坏 CTCs，因此无法对细胞进行形态学观察。ICC的基本机制是抗原抗体反应，利用单克隆抗体和特异性肿瘤标志物相结合，通过酶与底物反应显色判断肿瘤细胞的是否存在，对肿瘤细胞进行定量、定性、定位分析。其优点是简便，直观，缺点是因为肿瘤细胞表面抗原表达不均一，影响了检测的敏感度，亦可能出现假阳性率。FCM是以流式细胞仪作为工具，对悬液中的细胞进行测量和分析其优点是快速、定量，却不能提供细胞形态等方面的信息，尚不能很好的区别肿瘤细胞和正常细胞。鉴于以上方法尚不能单独提供足够的高特异性，因此为增加CTCs检测方法的特异性及敏感性，Gilbey等［6］认为多联合应用不同检测方法是非常有必要的。

2.3 微流控分析芯片技术 随着微流控和微机械加工技术(MEMS)的不断完善和发展，微流控芯片技术在细胞水平上的生物学研究和临床实验诊断等领域里的优势日趋显著。微流控芯片又称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)，是将生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成在一块芯片上，由微通道形成网络，可控流体贯穿整个系统。虽然微流控芯片技术进行 CTCs检测还在起步阶段，但此技术的出现却为CTCs检测技术的发展提供了新的方法和思路。

3 CTCs检测乳腺癌的临床应用

世界范围内乳腺癌已经成为女性最常见的恶性肿瘤［7］。在我国尤其是大城市里，乳腺癌的发病率也逐渐上升，其中复发和转移是乳腺癌患者主要的致死因素。血行播散是乳腺癌转移的重要途径，肿瘤细胞进入外周血是肿瘤远处转移的前提，因此乳腺癌是最早用来研究CTCs的，研究发现CTCs不仅存在于转移的患者中，在非转移的患者的循环系统中同样存在［8］，也是当前研究的较成熟的肿瘤。乳腺癌CTCs检测在诊断、治疗、评估疗效及提示预后等多方面具有重要的临床意义。

3.1 乳腺癌诊断 CTCs检测外周血标本较易采集，故对部分病理类型及肿瘤基因型和表型特征不明的患者可利用对CTCs的检测来协助诊断。血循环中检测到CTCs并不意味着有转移，但远处转移的概率会明显增加。Reinholz等［9］研究用CTCs的分子生物学特征来早期诊断乳腺癌。无肿瘤病史，乳腺钼钯片发现乳腺异常而准备行活检术的患者，用密度梯度离心法和免疫磁性分离法联合实时定量RT-PCR用于定量四种乳腺特异性基因：乳腺珠蛋白、GABA A(pi)、B305D-C和B726P的表达水平，发现乳腺珠蛋白或B305D-C大于诊断标准的敏感度和特异性分别达到70.5%和81.0%。认为用CTCs的分子生物学特征对乳腺浸润性癌的早期诊断有潜在价值。Camara等［10］检测手术前及术后30 min、60 min、3 d和7 d外周血中CTCs的变化，结果发现CTCs在术后30 min、60 min没有变化，在术后3～4 d85%的患者升至原来的1 000倍。随后CTCs出现下降，但58%的患者下降至手术前水平以上，直至开始术后辅助化疗，在未予进一步治疗或仅给予内分泌治疗的低危患者中，持续3年监测CTCs水平发现数量多、持续升高或仅有轻度下降，提示该部分患者CTCs可能长期存在，这些CTCs可能持续处于休眠状态，但可能在适宜条件下聚集并发展成为转移灶。

3.2 用于化疗疗效及预后预测的意义 CTCs检测的意义一般包括对新辅助化疗、辅助化疗的疗效评估及长期的随访监测。在一项研究中用CellSearch方法对118例新辅助治疗的乳腺癌患者进行CTCs检测发现，23%的患者在化疗前已经存在≥1个/7～5 ml外周血，在化疗后此比例降到17%;提示CTCs可作为评价新辅助治疗疗效的早期指标并且是代表PFS的一个预后因子，该方法已获 FDA批准用于临床［11］。Xenidis等［12］用RT-PCR方法检测437例乳腺癌患者辅助化疗前后CK-19mRNA表达。化疗前检测到CK-19mRNA的阳性细胞者与三个以上腋窝淋巴结阳性相关，辅助化疗后仍为阳性的患者其复发和疾病死亡显著增高，而无病生存和总生存显著降低，因此认为检测到CK-19mRNA阳性CTCs是无病生存和总生存下降的一个独立预测因子。Ignatiadis等［13］在术后辅助治疗前检测444例临床Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者的CTCs，总阳性率为40.8%，通过中位时间为53.5个月的随访，发现CTCs阳性组患者较CTCs阴性组患者易出现局部复发和远处转移，DFS显著缩短。多因素分析提示CTCs是DFS和OS最有价值的独立预测因子。Tewes等［14］根据对32例转移性乳腺癌患者进行治疗疗效分析，结果发现在16例治疗后CTCs阳性患者中，13例(81%)为疾病进展，仅有3例(19%)达到部分缓解;在16例治疗后CTCs阴性患者中，12例(75%)治疗有效，4例(25%)疾病进展，总计32例患者中25例的CTCs存在情况与治疗效果相关，提示CTCs可预测转移性乳腺癌患者的化疗疗效且预测率高达78%。另一项探讨CTCs与FDG-PET/CT预后价值研究［15］发现，在复发和进展性乳腺癌患者中，骨转移者出现较高的CTCs，且多发骨转移较单发或两个病灶CTCs数目要多。在多因素分析中，CTCs是OS的显著预测指标。

3.3 乳腺癌CTCs与个体化治疗 在CTCs的研究领域，另一个令人感兴趣的是内分泌和分子靶向治疗方案选择［16］。目前仍主要考虑原发肿瘤组织的ER、PR和HER-2状态，并未考虑CTCs。Xenidis等［17］对119例Ⅰ、Ⅱ期激素受体阳性的乳腺癌患者进行研究，结果显示5年他莫昔芬治疗期间，在任意时间点检测到CTCs阳性的患者PFS和OS均远短于任何时间均未检测到CTCs的患者，提示CTCs的变化与内分泌治疗的敏感性及患者预后密切相关，辅助化疗后体内残存有CTCs的患者，在5年他莫昔芬治疗后，循环血中仍检测到CTCs的患者比例高达68.2%，提示对化疗耐药的CTCs绝大部分对他莫昔芬也不敏感。Reuben等［18］报道2名原发肿瘤为ER阳性Her-2阴性但对常规内分泌治疗和化疗无效的患者，在随诊中发现多部位转移以及在一线治疗前相对数目较多的CTCs，且CTCs存在Her-2基因转录。在给予两周期多西他赛、卡铂化疗并联合Trastuzumab治疗后，患者症状减轻且PET/CT显示客观缓解。提示对于难治性乳腺癌，将CTCs的生物标记物作为治疗方案选择的基础有潜在可能性。

Meng等［19］检测24例乳腺癌患者CTCs的HER-2基因扩增情况，发现有9例(37%)患者虽原发肿瘤不表达HER-2，但是CTCs却有HER-2的扩增，提示在肿瘤进展过程中CTCs可获得HER-2扩增。Meng等［19］发现原发肿瘤HER-2表达阴性而CTCs中HER-2表达阳性的患者仍可获益于Herceptin治疗。对9例原发肿物HER-2表达阴性，CTCs获得HER-2基因扩增患者中的4例予以Herceptin治疗［20］，观察发现3例治疗有效，其中1例完全缓解、2例部分缓解。此外根据CTCs是否表达EGFR还可选择是否应用抗EGFR治疗［21］，分析乳腺癌患者的CTCs有助于制定更为精确和个体化的治疗方案，使更多的患者能接受并受益于内分泌及分子靶向治疗从而提高生存率。

3.4 乳腺癌 CTCs与肿瘤耐药性 Gradilone等［22］证实 CTCs多重耐药相关蛋白(multidrug-resistance-related proteins，MRPs)与ALDH1表达有统计学相关性。但ALDH1阳性与ALDH1阴性两组患者PFS并差异无统计学意义(P＞0.05)。提示CTCs中的肿瘤干细胞具多重耐药特性，这对于肿瘤细胞逃避药物杀伤，继续增殖可能是必要的，但也可能与系统治疗后的选择性有关［23］。

总之确定乳腺癌CTCs在临床中是非常有意义的［24，25］，检测CTCs有助于准确判断乳腺癌的预后［26］，并为评判和监测化疗疗效提供依据，有利于患者的个体化治疗，对于乳腺癌的研究前景有很大的潜在应用价值。CTCs检测在未来有望成为乳腺癌患者的临床常规检查。

1 Paterlini-Brechot P，Benali NL.Circulating tumor cells(CTCs)detection：clinical impact and future directions.Cancer Lett，2007，253：180-204.

2 Ashworth TR.A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death.Aus Med J，1869，14：146-149.

3 Graves H，Czerniecki BJ.Circulating tumor cells in breast cancer patients：an evolving role in patient prognosis and disease progression.Patholog Res Int，2011，2011：621090.

4 Sleijfer S，Gratama JW，Sieuwerts AM，etal.Circulating tumour cell detection on its way to routine diagnostic implementation.Eur J Cancer，2007，43：2645-2650.

5 De Mattos-Arruda L，Elattar I，Azim HA.Circulating tumor cells in metastatic breast cancer：the need for a standardized approach.Ann Oncol，2011，22：234.

6 Gilbey AM，Burnett D，Coleman RE，etal.The detection of circu1ating breast cancer cells in blood.J Clin Pathol，2004，57：903-911.

7 Paget S.Distribution of secondary growths in caneer of the breast.Laneet 1889，1：571-573.

8 Klein CA，Sehmidt-Kittler O，Sehardt JA，etal.ComParative genomic hybridization，loss of heterozygosity，andDNA sequence Analysis of single cells.Proc Natl Aead Sei USA，1999，96：4494-4499.

9 Reinholz MM，Nibbe A，Jonart LM，etal.Evaluation of apanel of tumor markers for molecular detection of circulating cancer cells in women with suspected breast cancer.Clin Cancer Res，2005，11：3722-3732.

10 Camara O，Kavallaris A，N schel H，etal.Seeding of epithelial cells into circulation during surgery for breast cancer：the fate of malignant and benign mobilized cells.World JSurg Oncol，2006，4：67.

11 Pierga JY，Bidard FC，Mathiot C，etal.Circulating tumor cell detection predicts earlymetastatic relapse afterneoadjuvant chem-otherapy in large operable and locally advanced breast cancer in aphase II randomized trial.Clin CancerRes，2008，14：7004-7010.

12 Xenidis N，Ignatiadis M，Apostolaki S，etal.Cytokeratin-19 mRNA-Positive Circulating Tumor Cells After Adjuvant Chemotherapy in Patients With Early Breast Cancer.J Clin Oncol，2009，27：2177-2184.

13 Ignatiadis M，Xenidis N，Perraki M，etal.Different prognostic value of cytokeratin-19 mRNA positive circulating tumor cells ac-cording to estrogen receptor andHER2 status in early-stage breast cancer.J Clin Onco，2007，25：5194-5202.

14 Tewes M，Aktas B，Welt A，etal.Molecular profiling and pre-dictivevalue of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer：an option for monitoring response to breast cancer related therapies.Breast Cancer Res Treat，2009，115：581-590.

15 De Giorgi U，Valero V，Rohren E，etal.CircuIating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cance r.Ann OncoI，2010，21：33-39.

16 Payne RE，Yagüe E，Slade MJ，etal.Measurements of EGFR expression on circulating-tumor cells are reproducible over time in metastatic breast cancer patients.Pharmacogenomics，2009，10：53-57.

17 Xenidis N，Markos V，Apostolaki S，etal.Clinical relevance of circulating CK-19 mRNA-positive cells detected during the adju-vant tamoxifen treatment in patients with early breast cancer.Ann Oncol，2007，18：1623-1631.

18 Reuben JM，Lee BN，Li Cetal.Circulating tumor cells and biomarkers：implications for personalized targeted treatments for metastatic breast cancer.Breast J，2010，16：327-330.

19 Meng SD，Tripathy D，Shete S，etal.HER-2 gene amplifica-tion can be acquired as breast cancer progresses.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101：9393-9398.

20 Pinzani P，Salvadori B，Simi L，etal.Isolation by size of epithelial tumor cells in peripheral blood of patients with breast cancer：correlation with real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction results andfeasibility of molecular analysis by laser microdissection.Hum Pathol，2006，37：711-718.

21 Payne RE，Yagüe E，Slade MJ，etal.Measurements of EGFR expression on circulating tumor cells are reproducible over time in metastatic breast cancer patients.Pharmacogenomics，2009，10：51-57.

22 Gradilone A，Naso G，Raimondi C etal.Circulating tumor cells(CTCs)in metastatic breast cancer(MBC)：prognosis，drug resistance and phenotypic characte rization.Ann Oncol，2011，22：86-92.

23 Cristofanilli M.The biological information obtainable from circulating tumor cells.Breast，2009，18：S38-40.

24 Okegawa T，Nutahara K，Higashihara E.Association of circulating tumor cells with tumor-related methylated DNA in patients with hormone-refractory prostate cancer.Int J Urol，2010，17：466-475.

25 Gradilone A，Petracca A，Nicolazzo C，etal.Prognostic significance of survivin-expressing circulating tumour cells in T1G3 bladder cancer.BJU Int，2010，106：710-715.

26 Botteri E，Sandri MT，Bagnardi V，etal.Modeling the relationship between circulating-tumour cells number and prognosis of metastatic breast cancer.Breast Cancer Res Treat，2010，122：211-215.