食品中有机磷农残前处理及检测分析技术

汪莉，陆利霞，熊晓辉，李壹

（南京工业大学食品与轻工学院，江苏南京210009）

我国是一个农业大国，农药的使用可以有助于防治病虫害和增加农作物产量。特别是有机磷农药因为它们的高药效性、光谱性、半衰期短等优点在过去的几十年里被大量使用[1]。但是不合理应用却对环境造成了严重的污染和破坏，还会对人类的健康产生不利影响[2-4]。由于食品生产在生产，储存，运输及销售等各个环节，都有可能受到污染，因此安全检测方法需体现快速。食品生产经营企业，质控人员，质检人员，进出口商检，政府管理部门都希望能够得到准确而又及时的监控结果。所以，发展快速、可靠、安全、灵敏和实用的农药残留前处理技术和检测技术，是食品安全的一项重要研究内容。常用的食品农药残留理化分析方法主要有液相和气相色谱法，此外还有免疫分析法、生物传感器法和酶抑制法等。

1 常用的前处理技术

1.1 超临界流体萃取法（SFE）

超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）是用超临界液体作为萃取剂，从组分复杂的样品中把所需的组分分离提取出来的方法，其最大优点是将萃取分离（精制）和去除溶剂等多个单元过程合为一体，大大简化了工艺流程，提高了生产效率。目前，SFE 技术已经在农药残留检测领域中得到广泛应用[5]。

1.2 加速溶剂萃取（ASE）

加速溶剂萃取（Accelerated Solvent Extraction，ASE）是一种在升高温度（50 ℃～200 ℃）和压力（1 013 MPa～2 016 MPa）条件下，用有机溶剂萃取的自动化方法。因其操作简单、基体影响小、回收率高等特点，适用于多种样品中多种农药的提取。Wu 等开发了一种新的分析方法，在动物源性食品中检测109 种农药残留[6]。采用加速溶剂萃取的方法有效提取脂肪样品中的农药，凝胶渗透色谱（GPC）进行净化，大多数农药的平均回收率是62.6%～107.8%，相对标准偏差≤20.5%。

1.3 QuEChERS 法

QuEChERS 法因其具有快速、简单、便宜、有效、可靠和安全等特点而得名[7-8]。该方法包括基于分配机理的样品提取和加入吸附剂的分散固相萃取两个步骤，稳定性好、精密度高、价格低廉且不使用含氯有机溶剂。Regina 等将此法用于甘蔗汁中的7 种农药残留量的测定[9]。用乙腈快速提取、无水醋酸钠和无水硫酸镁盐析后，经SPE 柱固相萃取净化，气相色谱电子捕获检测器检测。该方法加标回收率在62.9%～107.5%，相对标准偏差在1%～18%之间，检出限为0.003 mg/L～0.04 mg/L。

1.4 固相萃取（SPE）

固相萃取（Solid Phase extraction，SPE）是在环境分析中使用最广泛的的样品制备技术。SPE 的基本原理是用吸附剂吸附水相中的分析物，然后再用适当的有机溶剂洗脱分析物，用GC 或HPLC 进行分析[10]。Tian 制定了一种氯霉素、恩诺沙星和29 种农药残留量的测定方法[11]。用丙酮超声提取牛奶中的有机物后，经过C18-SPE 柱净化，以混合溶剂甲醇和水洗脱，采用HPLC-MS/MS 测定。该方法具有良好的线性关系，在研究的浓度范围内的所有测试化合物相关系数均大于0.991 0。

现今为了改善极性化合物的固相萃取的效率，许多新的亲水性吸附剂和改性吸附剂，通过引入极性基团已经研制出来。碳纳米管（CNTs）因为其具有高吸附能力，良好的热稳定性和较宽的pH 等优点，已经作为一种新型的固相萃取和固相微萃取吸附剂被广泛运用[12]。Katsumata 等将多壁碳纳米管做成多壁碳纳米管盘（MWCNTs disc），用丙酮溶液进行洗脱，分离和富集有机磷杀虫剂二嗪农以及农药莠去津和西玛津，用GC/MS 分离检测[13]。该方法的线性范围为0.1 ng/mL～1 ng/mL，检出限为2.5 pg/mL～5 pg/mL，RSD 为3.0%～6.9%。

1.5 固相微萃取技术（SPME）

固相微萃取（Solid-Phase Microextraction，SPME）是一种无（少）溶剂样品前处理新技术，它是用表面涂渍高分子层的石英纤维头对样品溶液中有机分子进行提取，然后直接进行GC、HPLC 等分析[14]。此方法需要很少的有机溶剂，因此不会产生有毒的残留物，集样品采集、萃取、浓缩、进样、解析为一体。Armindo 等采用固相微萃取（SPME）/高效液相色谱（HPLC）/二极管阵列检测器（DAD）技术对生菜中的有机磷农药进行提取测定[15]。实验中选用了四种不同的固相微萃取涂层：聚二甲基硅氧烷萃取性能（PDMS），聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB），聚乙二醇/模板树脂（CW/TPR）和聚丙烯酸酯（PA），通过优化三个变量（pH，氯化钠和提取时间），证明CW/TPR 达到最大的吸附效果。

1.6 液相微萃取技术（LPME）

液相微萃取技术（Liquid-phase microextraction，LPME）是近年来新兴的一种微型化样品前处理技术。它主要是根据液-液萃取的原理，用微量（一般只需几微升或十几微升）的有机溶剂对目标化合物实行萃取、净化、浓缩于一体目的。Sun 等用中空纤维液相微萃取技术（HF-LPME）对鱼肉组织中的有机磷农药进行检测[16]。实验中通过丙酮试剂对鱼样品进行提取，旋转蒸发后用水-甲醇（95 ∶5，体积比）溶解，再用聚偏二氟乙烯（PVDF）中空纤维进行萃取，检出限的范围在2.1 ng/g～4.5ng/g。此方法不仅降低了分析成本，也缩短了分析时间。

1.7 分子印迹技术（MIT）

分子印迹技术（Molecularimprintingtechnique，MIT）是指制备对某一特定目标分子（模板分子、印迹分子或烙印分子）具有选择性的聚合物，然后用特定的溶剂将模板分子洗脱的技术。ZHAO 等以壳聚糖作为基体聚合物、对硫磷为模板分子、硅酸四乙酯为交联剂制备了对硫磷分子印迹膜，将其固定于玻碳电极表面，通过检测示差脉冲伏安信号，实现了对有机农药对硫磷的选择性测定[17]。在优化的实验条件下，峰电流与对硫磷浓度在1 μg/L～10 μg/L 范围内有良好的线性关系，检测限可达24 ng/L。

2 常用的检测技术

2.1 色谱法

常用的仪器分析主要是色谱分析法，它是目前物质分离分析的重要手段。根据分析物质在固定相和流动相之间的分配系数的不同达到分离目的并将分析物质的浓度转换成易被测量的电信号电压电流等，然后送到记录仪记录下来的方法。目前在环境、生化药物、农药、精细化工产品分析等领域的应用日益普遍。应用于检测有机磷农药的色谱方法主要有气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC），色谱/质谱联用技术（GC/LC-MS），毛细管电泳法（CE）等，这些方法常常与以上农药前处理方法一起使用，能够进一步改进检测的准确度和灵敏度，同时也提高了对于复杂组分的定性、定量测定的能力。

2.2 免疫分析方法（IA）

免疫分析方法是以抗原、抗体的特异性识别和可逆性结合反应为基础的分析方法。近年来备受重视，是研究和应用较多的技术，适用于食品中农药残留检测的初筛，具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和很高的灵敏度。根据检测形式的不同，免疫分析方法分为酶联免疫吸附法（ELISA），流动注射免疫分析法（FIA），化学发光酶免疫测定（CIEIA），荧光免疫分析（IFA）等。

目前应用于有机磷检测的主要是酶联免疫吸附测定法，它是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的一种综合性技术，并且在现场筛选和大量样本的快速监测中显示出独特的优势。Xu Z.L 等对O，O-二乙基类有机磷农药特有的结构进行研究，合成了三种半抗原，并且制备出高特异性单克隆抗体，同时通过2D-QSAR 和3D-QSAR 进行了提高检测灵敏度及抗体识别能力的探讨[18]。韦倩妮等采用活泼酯法将三唑磷半抗原（TZPM-Hap）与牛血清蛋白（BSA）和卵血清蛋白（OVA）偶联，制备出免疫抗原（TZPM-A-BSA）和包被抗原（TZPM-A-OVA），并通过动物免疫试验，得到1 株产三唑磷单克隆抗体阳性细胞株（FC3），其抗体亚类为IgM[19]。该法IC50=9.7 μg/L，最低检测限（LOD）为1.0 μg/L，定量检测线性范围（IC20-IC80）为2.5 μg/L～100.0 μg/L。

2.3 生物传感器（Biosensor）

生物传感器技术由于其具有成本低，操作方便，响应速度快，灵敏度高等优点引起了人们的广泛关注[20-21]。测定有机磷农药的生物传感器大多数是基于有机磷对胆碱酯酶活性的抑制作用而设计，通常是以胆碱酯酶为分子识别元件，再加上简单的探测器组成。近年来，各种纳米材料已被广泛采用，用来提高电极的性能，如ZrO2纳米粒子的电极，多壁纳米管电极，普鲁士蓝修饰玻碳电极等。Shang Z J 等以多壁碳纳米管（MWNTs-COOH）固定乙酰胆碱酯酶，然后将其与银基汞膜电极藕合制得乙酰胆碱酯酶生物传感器，并用气相色谱测定萝卜中的辛硫磷和毒死蜱，最低检测线分别为9.0 ×10-5mg/L 和1.0×10-4mg/L[22]。Yong D 等建立了一种检测农药的电化学生物传感器，此法主要采用大肠埃希氏菌（大肠杆菌）作为测试模型的微生物，3，5-二氯苯酚（DCP）为参考毒物，通过毒性实验测量有毒物质对微生物的代谢活动作用[23]。对莠灭净，苯线磷和硫丹三种农药进行检测，其IC50值分别为6.5、22、5.7 mg/L。此结果证明，目前采用电化学生物传感器法是一种灵敏、快速和廉价的农药毒性检测方法。

2.4 酶抑制法（EIM）

酶分析法主要是利用有机磷对胆碱酯酶或植物酯酶活性的抑制作用来判断出样品中是否含有有机磷与氨基甲酸酯类农药，常见方法有：试纸法、比色法，固相酶速测法、荧光法等。这些方法总体灵敏度高、操作简便成本较低、结果可靠，适合现场检测、大批样品筛选检测。

目前市场上常用酶源主要分为乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、丁酰胆碱酯酶（butyrylcholinseterase，BChE）和植物酯酶。利用它们被OPs 特异性抑制的原理，可以作为生物标志物用于农业、食品、环境、军事等领域中有机磷化合物的检测。Ding 等从来源丰富的罗非鱼头部提取乙酰胆碱酯酶粗酶液，通过Triton-100 溶液进行提取，经过硫酸铵分级沉淀，Sephadex G-100 和DEAE 纤维素柱分离纯化后，使得粗酶液活力达到20.628 U/mg[24]。从水体生物中筛选和纯化AChE，对于提高酶的检测灵敏度以及酶在水环境中的适应性具有重要的意义。朱鸿等采用丙酮脱脂、酸沉淀、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换和凝胶层析方法，分离纯化得到鸭肝丁酰胆碱酯酶，酶活回收率为23.60%，比活达17.21 U/mg。纯化后的酯酶可以成为有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的重要作用靶标[25]。王亚飞等利用酶抑制原理，对不同来源的植物酯酶进行筛选，以总酯酶活力、比活力及对有机磷农药的灵敏度为筛选指标，最终确定选择苜蓿作为有机磷类农药残留快速检测用植物酯酶的适宜酶源[26]。

3 展望

随着人们对食品安全和环境保护的日益重视，食品安全快速检测技术的应用价值日显突出。由于有机磷农药的残留量水平很低，所以为了保证高度的准确性，大部分的检测技术都需要与一些精密的分析仪器联用，价格极其昂贵，操作复杂，不适合现场的快速检测；而目前存在的一些快检方法仍然不够成熟，有其一定的局限性，因此发展快速、安全、环保、准确度高的检测技术必定成为所有研究人员所致力的方向。

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