昆虫对Bt毒素的抗性与中肠蛋白酶、解毒酶及保护酶系活性的关系

蒋 晴，苏宏华，杨益众

(扬州大学园艺与植物保护学院，江苏 扬州 225009)

自美国太平洋酵母公司1957年生产出第一个苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis，Bt)商品制剂以来，Bt作为一种对人畜安全、无环境污染的微生物杀虫剂，在农林及卫生害虫的防治中发挥了重要作用，成为国内外开发应用最成功的一种生物农药。70年代，比利时Montagu实验室首次报道将Bt－δ内毒素转入烟草获得转基因烟草，随后相继出现转Bt西红柿、马铃薯、棉花、玉米等转基因作物。我国于1996年在河北、山东、河南等地开始大面积种植转Bt基因棉花 (谭声江等，2001)。Bt生物农药和转Bt基因作物的推广使用有效地减少了化学农药的用量，保护了生态环境。但是，转基因作物的生态风险也不容忽视，其中最主要的生态风险就是害虫的抗性问题(McGaughey，1994;Candas et al.，2003)。如同各种化学农药的使用一样，害虫在持续选择压力下，也会对Bt毒素产生抗性。McGuaghye于1985年首次报道了在实验室条件下印度谷螟Plodia interpunctella对 Bt毒素产生了抗性 (Johnson，1990)，其它还有鳞翅目、鞘翅目、双翅目等十几种昆虫也能对 Bt毒素产生抗性 (Ferré and Van Rie，2002)。不过与化学杀虫剂相比，害虫对Bt毒素产生抗性的速度比较慢 (梁革梅等，2001)。

Heckel(1994)分析了昆虫对Bt毒素产生抗性的10种潜在机理，归纳如下:(1)Bt毒素的溶解性:原毒素不能溶解或溶解性降低;(2)Bt原毒素的蛋白水解性:水解不充分或过度水解;(3)毒素与细胞膜上受体的结合:毒素与受体的结合由于竞争性抑制而受阻、受体的一级结构或二级结构的修饰作用发生改变，导致毒素与受体的结合位点减少;(4)细胞膜上孔洞的形成:孔洞形成受阻或孔洞阻塞;(5)中肠上皮的修复作用;(6)行为机理等。从现有资料看来，细胞膜上毒素与受体结合力的改变是最热门的研究内容，也被认为是抗性产生的最主要环节 (谭声江等，2001)。如在印度谷螟中，抗性种群的中肠上皮细胞刷状缘膜囊 (Brush border membrane vesicles，BBMV)结合力下降了50倍，导致毒性降低100倍以上 (van Rie et al.，1990)。Ferré和Tabashnik研究发现Bt毒素与BBMV结合力的下降是抗性的主要机理 (Ferré et al.，1991;Tabashnik，1994)。比较而言，害虫取食Bt毒素后其体内酶活性的变化与抗性之间关系的研究报道则较少。一些研究者认为，害虫对Bt毒素产生抗性有可能依赖于抗性昆虫体内一些酶的水平或类型的变化。中肠蛋白酶、解毒酶和保护酶是昆虫体内最主要的三大酶系，本文着重综述害虫对Bt毒素产生抗性与这三大酶系之间的关系。

1 中肠蛋白酶

中肠是昆虫消化吸收食料的重要场所，也是Bt毒蛋白的作用部位，更是Bt毒蛋白杀虫机理研究涉及的重要组织。昆虫中肠蛋白酶是中肠上皮细胞分泌的能激活Bt原毒素的重要酶系，研究Bt毒蛋白对中肠蛋白酶生物化学的影响对于Bt毒素的作用方式和致病机理具有重要意义 (徐艳聆等，2006a)。国内外已有多篇报道确认中肠蛋白酶与抗性的产生密切相关，甚至认为是抗性产生的主要机理。Oppert等 (1997)在研究了抗性印度谷螟中肠蛋白酶活性后发现，抗性的产生是由于酶活的降低，随之减弱了对原毒素的活化作用，进一步的研究发现其酶活的降低是因为缺失了一种重要的中肠蛋白酶，而且发现其对原毒素抗性要比活化毒素的抗性高11倍。这表明中肠蛋白酶参与了抗性的产生。Candas也得出了类似的结论(Candas et al.，2003)。Liu等 (2000)研究发现抗性小菜蛾Pultella xylostella对CryAc原毒素的抗性比对活化CryAc毒素的抗性高2.5倍，说明蛋白酶活化作用的降低参与了抗性的组成。Huang等(1999)研究也发现:在欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis中，蛋白酶活化作用的降低是一个重要的抗性机理。除了中肠蛋白酶对Bt原毒素的活化作用减弱会导致昆虫对Bt毒素产生抗性外，中肠蛋白酶对Bt毒素降解作用的增强也会导致抗性的产生。Keller等 (1996)研究发现海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis 5龄幼虫体内中肠蛋白酶活性升高与其对Cry1C的不敏感性有关。这可能是因为中肠蛋白酶加快了对毒素的降解。Forcada等(1996)对抗性烟芽夜蛾Heliothis virescens的研究表明:抗性的产生是由于中肠蛋白酶对原毒素活化作用的下降及对活化毒素降解作用的上升。

昆虫中肠内的蛋白酶根据其氨基酸序列及对金属离子的依赖性可分为丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等。而在鳞翅目昆虫的中肠内主要以类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶等丝氨酸蛋白酶为主。另外类胰蛋白酶又可进一步分为强碱性类胰蛋白酶和弱碱性类胰蛋白酶 (Applebaum，1985;王琛柱和钦俊德，1996)。到底是哪种酶在起主导作用结论不一。邵宗泽研究表明，类胰凝乳蛋白酶在降解Bt毒素的过程中起着主导作用 (邵宗泽和喻子牛，1999);Zhu等研究发现，印度谷螟对Bt毒素抗、感种群体内类胰凝乳蛋白酶的含量有差异:抗性种群比敏感种群低了近3倍 (Zhu et al.，1997)。史艳霞等(2009)通过对Cry1Ac抗性和敏感棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶基因的半定量RT－PCR测定证明:相同虫龄的抗性品系棉铃虫体内的类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的表达量明显高于敏感品系。张继红等 (2001)研究发现棉铃虫中肠液的各分离组分都可对δ－内毒素进行降解，说明δ－内毒素的降解活化是多种蛋白酶共同作用的结果，但类胰蛋白酶对δ－内毒素的降解速率显著快于其它分离组分的蛋白酶。而梁革梅等 (2001)研究发现，棉铃虫抗感品系的弱碱性类胰蛋白酶和类凝乳蛋白酶活力差异不显著，但强碱性类胰蛋白酶差异较大，说明棉铃虫对Bt毒素产生抗性可能与中肠强碱性类胰蛋白酶活性的增强有关。徐艳聆等对取食转基因抗虫玉米的亚洲玉米螟O.furnacalis幼虫体内的中肠蛋白酶研究后也发现，弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活力差异不显著，但强碱性类胰蛋白酶的活性显著高于对照。推断强碱性类胰蛋白酶可能与亚洲玉米螟对Bt毒素抗性的产生有关 (徐艳聆等，2006a;2006b)。相反，李光涛 (2004)报道欧洲玉米螟抗性种群的强碱性类胰蛋白酶的活力明显低于敏感种群。Oppert等 (1997)也报道印度谷螟的抗性种群强碱性类胰蛋白酶活力显著低于敏感种群。

2 解毒酶

大多数研究认为，解毒酶在昆虫对杀虫剂的解毒方面起着至关重要的作用，且与害虫对杀虫剂产生抗性有关 (邓业成等，1995;刘泽文等，2003;黄水金等，2007;Armes et al.，1997;Cho et al.，1999)。相对而言，Bt毒蛋白对昆虫体内解毒酶活性的影响及解毒酶与抗性之间关系的研究则较少。尽管如此，目前已有少量报道证明昆虫的解毒酶系受Bt毒素的影响，解毒酶可能直接参与了Bt杀虫蛋白的代谢作用并与抗性的形成有关(梁革梅等，2001)。

昆虫体内的解毒酶系主要是以羧酸酯酶、谷胱甘肽－S－转移酶、乙酰胆碱酯酶为代表的酶系，它们对分解外源毒素、维持昆虫本身正常的生理代谢起着重要作用。

2.1 羧酸酯酶 (carboxylesterase，CarE)

酯酶 (esterases)是昆虫体内一类重要的解毒酶系，它作为水解酯类的酶在许多昆虫抗药性中起着十分重要的作用。羧酸酯酶作为B－酯酶或酯族酯酶在有机磷抗性中的作用极为重要，其次是对拟除虫菊酯类农药的抗性 (唐振华，1993)。在昆虫与Bt毒蛋白的抗性关系中，有研究表明该酶同样起着很重要的作用。Guo等 (2010)用Bt毒蛋白连续饲养甜菜夜蛾Spodoptera exigua 3代后发现，该虫第二代和第三代体内的羧酸酯酶含量显著高于第一代，它成为甜菜夜蛾逐渐适应Bt毒素的重要证据。张少燕等 (2004)研究发现，棉铃虫幼虫取食含不同浓度Bt毒蛋白的人工饲料后，体内的羧酸酯酶活力随Bt毒蛋白浓度的升高呈上升趋势。Candas比较了印度谷螟抗性种群和敏感种群后发现，抗性种群体内的羧酸酯酶活性比敏感种群体内的高，这意味着羧酸酯酶活性的升高有可能是抗性产生的原因之一 (Candas et al.，2003)。但也有研究表明，羧酸酯酶与昆虫对Bt毒素抗性的产生无关:张炬红等 (2006)研究了在抗虫棉GK12上取食1代和21代的棉蚜Aphis gossypii，发现其羧酸酯酶活力与取食亲本常规棉的棉蚜之间差异不显著。许新军 (2005)研究发现，对Bt抗性和敏感品系的棉铃虫体内羧酸酯酶活性也没有显著差异;另外，对斜纹夜蛾Spodoptera litura、烟粉虱Bemisia tabaci等的研究都表明羧酸酯酶与昆虫对Bt毒蛋白的抗性无关 (杨进等，2008;姜涛等，2008)。

2.2 谷胱甘肽－S－转移酶 (glutathione S transferases，GSTs)

GST是一类催化内源还原谷胱甘肽(glutathione，GSH)与包括杀虫剂在内的各种外源化合物共轭作用的胞液酶。其功能是内源GSH与有害的亲电子基团结合，并把它们排泄出体外(郭庆龙，2007)。谷胱甘肽－S－转移酶的研究最早集中在家蝇与有机磷的关系上，发现该酶对抗药性的产生起着重要作用。现有研究发现，该酶活的变化与 Bt毒蛋白的抗性也有一定关系。Candas比较了印度谷螟抗性种群和敏感种群后发现，抗性种群体内的GSTs活性比敏感种群体内的高，这意味着GSTs活性的升高有可能是抗性产生的原因之一 (Candas et al.，2003)。当然也有研究表明该酶与抗性的产生无关。姜涛等 (2008)测定了取食转双价基因棉SGK321及其亲本棉SY321烟粉虱体内谷胱甘肽－S－转移酶的活性发现，SGK321对烟粉虱体内谷胱甘肽－S－转移酶活性均值无显著影响。许新军 (2005)研究发现，对Bt毒素产生抗性和敏感品系的棉铃虫体内谷胱甘肽－S－转移酶活性没有显著差异，这表明棉铃虫对Bt毒素的抗性与GSTs无关。

2.3 乙酰胆碱酯酶 (acetylcholine esterase，AChE)

乙酰胆碱酯酶是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂与乙酰胆碱酯酶结合形成复合体，然后发生酶的磷酰化或氨基甲酰化，造成酶活被抑制。当它被抑制后，乙酰胆碱 (acetylcholine，Ach)就在突触处积累，过量的Ach造成去极化阻断，从而抑制正常的神经传导并最终导致昆虫的死亡 (郭庆龙，2007)。因此，该酶的变异会导致昆虫对化学杀虫剂产生抗性。但Bt毒蛋白的杀虫机理与有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂的作用机理不相同:一般认为Bt毒蛋白对昆虫的毒杀机理是:昆虫摄入杀虫蛋白之后，在昆虫中肠强碱环境和蛋白水解酶的作用下，杀虫蛋白晶体被溶解并激活，活化的蛋白引起中肠膜上皮细胞破裂、中肠麻痹，导致昆虫死亡 (喻子牛，1990)。从这个机理看，昆虫对Bt毒蛋白产生抗性与乙酰胆碱酯酶的变化并没有直接联系，也有研究表明两者之间是无关联的。如张炬红等 (2006)研究发现在抗虫棉GK12上取食1代和21代的棉蚜，其乙酰胆碱酯酶的活力与取食亲本常规棉的棉蚜之间无差异。姜涛等(2008)测定了取食转双价基因棉SGK321及其亲本棉SY321后烟粉虱体内乙酰胆碱酯酶的活性，发现SGK321对烟粉虱体内乙酰胆碱酯酶活性均值无显著影响。徐艳聆等 (2006b)通过比较对Cry1Ab杀虫蛋白产生抗性的亚洲玉米螟种群和敏感种群幼虫体内解毒酶后发现，抗、感种群的乙酰胆碱酯酶活力差异不显著。可见，Bt毒蛋白对AChE的活力无显著影响。但国外的研究发现，Bt毒蛋白也能作用于昆虫的突触前末梢从而抑制突触传导 (Singh and Gill，1985;Chilcotta et al.，1984)，最终对神经产生麻痹作用。由此看来，乙酰胆碱酯酶活性的变化也可能与昆虫对Bt毒素产生抗性有关。张少燕等 (2004)研究发现，棉铃虫幼虫取食含不同浓度Bt毒蛋白的人工饲料后，体内乙酰胆碱酯酶活力随Bt毒蛋白浓度的升高呈上升趋势。梁革梅等研究发现，棉铃虫Bt抗性种群体内的乙酰胆碱酯酶活力显著高于敏感种群，并认为乙酰胆碱酯酶作为分解代谢酶可能直接参与了Bt的代谢作用 (梁革梅等，2001)。张健华(2001)研究也证明乙酰胆碱酯酶的活力是棉铃虫对Bt棉产生抗性的重要原因。Guo等 (2010)通过用Bt毒蛋白连续饲养甜菜夜蛾3代后发现，第一代用Bt毒蛋白饲养的甜菜夜蛾体内的乙酰胆碱酯酶含量显著少于对照，但到了第二代、第三代体内的乙酰胆碱酯酶含量已显著高于第一代，说明乙酰胆碱酯酶是甜菜夜蛾后代适应Bt毒蛋白的重要因素。以上两种截然不同的结论是否与害虫种类有关或是其他原因还需要进一步研究探讨。

3 保护酶

超氧化物歧化酶 (superoxidedismutase，SOD)、过氧化氢酶 (catalase，CAT)和过氧化物酶 (peroxidase，POD)是生物体内普遍存在的三种防御氧化损伤的重要保护酶 (李周直等，1994;李会平等，2006)。SOD和CAT广泛存在于昆虫体内，POD在大多数昆虫体内也已发现，但在许多鳞翅目昆虫中肠内未发现其活性，如甜菜夜蛾、粉纹夜蛾 Trichoplusia ni、大豆夜蛾 Pseudoplusia includens和烟草夜蛾 Heliothis virescens。值得一提的是，上述POD活性的测试是用专一性不强的底物愈创木酚 (guaiacol)。该方法也许不能完全反映昆虫体内的真实情况 (毅平和龚和，1998;Felton and Summers，1995)。

据研究，当昆虫取食Bt毒蛋白后可能会使体内保护酶的平衡遭到破坏，过量的O2－就会使机体损伤。此时昆虫就会以升高保护酶活性的方式来保护和维持机体的正常功能，从而对Bt毒蛋白产生抗性 (张志罡等，2011)。Ding等 (2001)研究证明，昆虫的保护酶受Cry1Ab蛋白的影响而发生变化，推测它可能参与了Cry1Ab蛋白的代谢作用并与抗性的产生有关。郭建英 (2010)等发现超氧化物歧化酶在对Bt毒素或其他次生代谢化合物的快速解毒过程中起着重要作用。对于保护酶与昆虫对Bt毒素抗性方面的研究报道还较少，有待进一步探索。

4 小结

虽然Heckel分析了昆虫对Bt毒素产生抗性的10种潜在机理，但至今未有定论。根据本文的综述，昆虫体内三大酶系与Bt毒素抗性产生的关系也不完全一致。这可能与昆虫种类、转Bt基因作物、基因导入方式等不同有关。如用取食含Bt毒蛋白的人工饲料与直接取食转基因作物相比，外源杀虫基因的导入可能会使作物体内的次生代谢物质或营养物质含量发生改变，从而引起昆虫体内一些酶活的变化，最终导致研究结论的不同(武予清等，2000;张永军和郭予元，2000)。因此，多方位、多角度以及长期监测昆虫对Bt毒素产生抗性的机制，将有助于进一步筛选、利用最有效的Bt毒素，发展多样化Bt制剂及转Bt基因作物，延长Bt制剂和Bt植物的使用寿命。

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