生物学指标与阿尔茨海默病的诊断

彭誉，周华，邱晨红，孙沁怡，王锋，谢红娜，赵中

(南京医科大学附属苏州医院神经内科，江苏苏州215001)

·综述·

生物学指标与阿尔茨海默病的诊断

彭誉，周华，邱晨红，孙沁怡，王锋，谢红娜，赵中

(南京医科大学附属苏州医院神经内科，江苏苏州215001)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是痴呆中最常见的类型。到目前为止，临床诊断的AD患者基本都已经处于中晚期，已没有可明显逆转已有损害或终止疾病进展的有效治疗措施。因此，治疗AD的希望在于早期识别和早期干预。近年来，一系列新的生物学指标研究有助于阿尔茨海默病的早期识别。

阿尔茨海默病；生物学指标；硝化应激；早期诊断

AD是一种以痴呆为主要特征的渐进性神经变性疾病，除了少数的患者为家族遗传性者外，绝大多数为散发的、年龄超过65岁的老年期AD。病理上以细胞外老年斑(Senile plaques，SP)、细胞内神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFT)、广泛神经元缺失(Neuronal loss)为主要特征。现研究认为，AD的发病进程经历症状前AD、轻度认知障碍(Mild cognitive impairment，MCI)进而逐步发展为AD。随着老龄化社会到来，AD患者数量不断增加，高患病率带来沉重的社会和经济负担，故早期诊断及预防成为治疗的关键。然而自1984年美国国家神经病及语言障碍和卒中研究所(National Institute of neurological and communicative disorders and stroke，NINCDS)-阿尔茨海默病及相关疾病学会(Alzheimer's disease and related disorders association，ADRD)发布了AD的临床诊断标准即“NINCDS-ADRDA标准”以来，AD的各种诊断标准均只是限于临床诊断，一旦临床诊断AD，其病理改变和神经变性已充分形成且不可逆，因此建立AD早期诊断方法具有极其重要的意义。

2007年，Dubois等[1]提出了生物学标记物在诊断AD中的作用，以期提高诊断的准确性。2011年，美国国家衰老研究所(National institute of aging，NIA)和阿尔茨海默病学会(Alzheimer's association，AA)发布了AD新的诊断标准即“NIA-AA”诊断标准[2-4]，该标准将生物标志物纳入到AD痴呆诊断标准中，虽仅供研究应用，但此为权威机构首次将生物标记物纳入AD诊断标准，为AD诊断特别是早期诊断指明了研究方向。本文将对近几年来研究比较广泛的一些AD生物学标记物进行综述。

1 β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)

SP作为AD典型三大特征性病理改变之一，其主要成分为蛋Aβ。Motter等[5]在1985年从AD患者脑内的淀粉样肽纤丛中分离到一种分子量为39 000 Da和43 000 Da的多肽，并命名为Aβ，其是淀粉样前体蛋白(β-Amyloid peptide precursor，APP)经蛋白水解酶作用的底物。APP至少可以被三种酶加工，其切割途径可分为α分泌酶途径和β分泌酶途径。在β分泌酶途径中，APP首先被β分泌酶裂解，然后在γ分泌酶作用下，切割丙氨酸713和苏氨酸714之间位点产生AP1～42，切割缬氨酸711和异亮氨酸712之间位点，形成Aβ1～42。Aβ1～40和Aβ1～42为Aβ最主要的两种成分，其中Aβ1～40占神经细胞分泌Aβ的90%～95%[6]。Aβ1～40比Aβ1～40多两个疏水性氨基酸，因而具有更高的聚集能力，最先在AD患者的脑内积聚，是SP的主要成分，提示它在AD发病机制中占有更重要的作用[7]。脑脊液(Cerebrospinal fluid，CSF)直接与脑细胞间隙相连，因此脑细胞的生化变化可通过对CSF的分析直接反映出来，是最理想的检测标本。而Aβ能通过血脑屏障进入CSF和血浆之中。

继Motter等[5]最早报道AD患者CSF中Aβ1～40浓度明显较对照组降低后，已有大量研究显示，与健康正常人比较，早期AD和进展型MCI患者CSF中Aβ1～40明显降低[8-10]。如Jagust等[8]比较了AD患者和健康老人，AD患者CSF内Aβ1～40浓度显著下降，约是健康老人水平的50%。CSF中Aβ1～40水平降低的原因目前还不十分清楚，但可能与Aβ1～40可溶性强，易于积聚成SP沉积于脑内有关。Gleecknerd等[11]对包括AD、克-雅氏症、Lewy痴呆、额颞叶痴呆以及正常压力脑积水在内的106例患者及其正常对照组CSF Aβ1～40，Aβ1～40进行了定量分析，结果发现，Aβ1～40水平在所有的痴呆类型中都降低。Hompel等[12]也得出类似结论。这就表明，虽然CSF中Aβ1～40可以区分AD患者与其对照组，然而Aβ1～40水平降低并不能辨别AD患者和其他脑内具有Aβ沉积的疾病，提示CSF内Aβ1～40作为AD诊断标记物的特异性不够高。相比之下，AD患者CSF中Aβ1～40的水平往往不变或轻度增高，有研究证实AD患者CSF内Aβ1～40/Aβ1～40的比值降低，而且可很好的鉴别AD和非AD型痴呆，弥补了Aβ1～40单独用于预测和诊断AD特异性低的不足，而且在预测MCI发展为AD方面比Aβ1～40更加有效[13]。但至今为止，关于这两个指标比值的敏感性和特异性，研究的数据不多。

临床工作中，血标本的采集相对脑脊液更具有优势，故研究血液中AD生物学标志物近年来明显增多。纵向研究显示，AD患者血浆中Aβ并没有显示出长期的变动。如Mayeux等[14]研究显示，AD患者血浆Aβ虽会增高，但与对照组差异无统计学意义。有的研究结果认为血浆中Aβ1～40或Aβ1～40水平与对照差异无统计学意义[15]。因此，血浆Aβ能否作为AD临床诊断生物学指标，仍有待进一步研究证实。

2 Tau蛋白

NFT主要成分为成对螺旋丝(PHF)，Tau蛋白是组成PHF/NFT的唯一必需成分，是一种微管结合蛋白，它可以通过与微管的结合促进微管组装，稳定微管结构，维持细胞形态。PHF的亚单位是过度磷酸化Tau蛋白(P-tau)，而P-tau失去与微管结合的能力，在细胞内聚集成双螺旋纤维，进而形成神经元纤维缠结，参与AD的发病。

对于CSF中Tau升高的报道最早见于1993年[16]，此后研究显示AD患者CSF中总Tau蛋白(T-tau)水平在AD早期，尚未出现临床症状之前已有异常增高，而且持续增高在整个疾病发展阶段，提示在AD早期诊断有一定的参考价值[17]。但单独使用T-tau蛋白检测作为诊断指标缺乏足够的特异性，研究显示CSF中T-tau蛋白增高也见于非AD型痴呆[11-12]，其不能作为区分患者痴呆类型的标记物。P-tau蛋白作为NFT的主要组成部分，目前发现其有37个异常磷酸位点[18]，其中研究较多的有181、199、231、396及404等多个磷酸位点，已在AD患者的CSF中检测到高浓度上述位点的P-tau蛋白，并具有较高的特异性和敏感性。研究发现CSF P-tau231、P-tau181和P-tau199可鉴别AD和正常对照组，P-tau231、P-tau181可分别用于AD与额颞痴呆、路易体痴呆的鉴别诊断。研究同样显示P-tau231和P-tau199将AD与其他神经系统疾病相鉴别的灵敏度和特异度均为80%～90%[18]。这些研究表明，检测CSF中T-tau的磷酸化位点可能有助于AD的早期诊断和鉴别诊断。目前对MCI及AD患者外周体液中Tau蛋白研究较少，血浆中Tau蛋白与痴呆诊断关系还需大量研究。

3 Aβ与Tau蛋白的联合检测

Hansson等[19]综合脑脊液A降低，T-tau蛋白和P-tau蛋白升高，或者P-tau/T-tau的比值变化，预测认知功能障碍是否进展为阿尔茨海默病，敏感性为90%，特异性为85%。欧洲12个研究中心对750例认知功能障碍患者的前瞻队列研究中随访2年，CSF Aβ1-42/T-tau比值鉴别阿尔茨海默病前期的敏感性为83%，特异性为72%，阳性预测值为62%，阴性预测值为88%[20]，提示Aβ1-42、T-tau和P-tau能够预测认知功能障碍患者的预后。近来有报道应用夹心ELISA法检测CSF中Aβ1-42，Tau，P-tau(181P)，并用核磁共振技术分析相应样本的内侧颞叶，以比较两者在AD诊断上的一致性[21]。结果发现，CSF标记物和核磁共振成像在诊断方面没有相关性，但均有助于AD的诊断。在缺乏内侧颞叶数据的情况下，CSF生物学标记物分析是最灵敏的方法，尤其是在早发型AD患者诊断方面。这些研究表明，联合分析脑脊液中Aβ1-42降低以及Tau升高两种指标，能够显著提高AD诊断的特异性。

4 硝化应激与硝化氧化物

硝化应激即蛋白质的硝化作用，是指由一氧化氮(Nitric oxide，NO)或由NO衍生的活性氮族(Reactive nitrogen species，RNS)与活性氧族(ROS)共同联合发生的生物化学作用[22]，使细胞内蛋白质中的酪氨酸硝化成3-硝基络氨酸(3-Nitrotyrosine，3-NT)，引起细胞损伤或凋亡，从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。硝化应激的标志物主要为RNS，RNS指的是NO、HNO2、ONOO-、NO2等，3-NT的形成被认为是体内RNS形成的生物标志[23]。RNS的形成离不开ROS，氧化应激状态下RNS/ROS水平的升高将导致蛋白质的硝化。硝化应激是与氧化应激密切相关，活性氮及活性氧联合反应引起的蛋白质翻译后修饰，且与氧化应激密切相关的活性氧如超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH)、过氧化氢(H2O2)、NO等与活性氮的生成和清除途径相交叠并互相调节[24]。当体内发生氧化应激时，产生大量的NO和活性氧。一方面NO和O2-反应生成过氧亚硝酸根离子ONOO-，它既可以作为硝化剂，又可以作为强氧化剂，与蛋白质、脂质、核酸等生物大分子反应；另一方面NO的氧化产物亚硝酸盐与H202共存时，在过氧化物酶的催化下，也能作为硝化剂和氧化剂损伤蛋白质及核酸。因此蛋白质硝化和氧化应激作用能影响蛋白质的二、三、四级结构，进而影响细胞的信号传导、细胞骨架、酶催化作用，产生炎症反应，影响细胞的生存，参与AD的发病[25]。

大量研究报道显示，活性氮氧化物与AD的发病有着密切的关联[26]。如Sinem等[27]对15例未接受任何治疗的AD患者和62例接受抗胆碱之酯酶抑制剂和抗精神失常药物治疗研究发现，未接受治疗AD患者血浆NO、3-NT显著增高，短期接受抗胆碱酯酶抑制剂和抗精神药物治疗的AD血浆NO、3-NT等显著降低，这与AD患者氧化应激导致iNOS量和活性的增加，进而导致血浆NO浓度的升高，而过多的NO可进一步生成3-NT[28]。但也一些研究显示[29-31]，AD患者血浆NO、3-NT水平未显著发生变化，甚至是降低，其可能的原因有：所取标本时间过长，由eNOS、nNOS催化生成的NO半衰期仅数秒，而由iNOS产生的NO半衰期也就数小时，测量时NO已经代谢分解，产生3-NT原料减少，同时抗胆碱酯酶抑制剂的治疗也能影响结果[26，27]。同时研究还发现AD患者血浆NO、3-NT浓度与MMSE评分呈负相关[28]，即AD患者血浆NO、3-NT浓度越高，MMSE评分越低，提示血浆NO、3-NT浓度可以反映AD患者认知功能损害程度，而Sinem等[27]研究还发现血浆NO水平与3-NT水平呈正相关。推测其机制可能为：①阿尔茨海默病的发病机制与氧化应激密切相关，当机体受到感染、疾病或环境等的影响时，机体氧化水平超过抗氧化水平，活性氧簇和活性氮簇等高活性的分子就会大量堆积，而高浓度的NO参与Aβ的神经毒性作用，导致AD的产生[32-33]。②研究显示，AD患者存在明显的内颞叶结构病变，包括海马结构、杏仁核和海马旁回，而这些位置的糖代谢效率较高，对氧的需求最高，线粒体氧化磷酸化的同时能产生大量的氧自由基和氮自由基，而上述结构清除自由基和抗氧化能力较差，而这些部位是脑认知功能重要的结构基础，其损害程度与认知功能下降幅度相关[34]。当各种危险因素导致上述部位损害时，损害愈重，认知功能下降愈明显，NO，3-NT升高也越显著。

5 氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)

脑内胆固醇主要以非酯化形式存在于髓鞘、星形胶质及神经细胞膜，主要参与髓鞘的构成。现阶段普遍认为胆固醇在脑内自体合成，脑外胆固醇对脑组织胆固醇含量无明显影响，而脑组织多余的胆固醇会转移到外周。研究显示，脑组织胆固醇含量改变会影响APP和Aβ的表达量，参与AD的发病[35]。研究显示，神经退行性病变，尤其AD患者脑组织胆固醇转移增加，但完整的血脑屏障会限制胆固醇从脑组织到周围血液循环的直接运输[36]。胆固醇需要依靠相关脂蛋白作为载体才能转出脑组织，尤其是主要分布于脑组织和脉络膜周围的低密度脂蛋白(LDL)能通过血脑屏障[37]。在AD中，变性的神经元和突触释放胆固醇含量增加，而脂质蛋白更对氧化应激和神经毒性更加敏感，形成稳定的氧化脂蛋白[38]。Sinem等[27]研究显示，AD患者血浆ox-LDL浓度显著高于正常对照组，同时AD患者血浆ox-LDL浓度与MMSE评分呈负相关，可能与AD患者脑组织胆固醇转移增加，低密度脂蛋白含量增加，在氧化应激和硝化应激环境下，低密度脂蛋白更易被氧化，导致含量增加[37]。Konukoglu等[39]对30例AD患者、20例血管性痴呆患者以及15例认知功能正常患者研究发现，AD患者血浆ox-LDL浓度较两对照组显著升高，而Zafrilla等[40]的研究发现，轻中度AD患者血浆ox-LDL浓度，而重度AD患者变化不明显。但本实验室正在进行的实验表明，血浆ox-LDL浓度的升高不仅存在于AD患者中，还存在于其他类型的痴呆患者中，具体原因还待进一步分析。

6 展望

AD患者的病程可持续15年或以上，对其诊断非常重要。虽然运用ELISA方法测量CSF Aβ1～42，T-tau，和P-tau水平作为AD诊断手段之一已基本得到认可，而且具有高度特异性和高灵敏度，但是在推向临床之前还需进一步完善和规范，尤其是检测的标准化和诊断的临界值的确立还需要进一步的分析。另外CSF标本的特殊性也对临床广泛应用造成一定得限制。近年来，大量研究偏向于血浆中生物学指标，如Aβ抗体、炎性因子、HSP、NO、3-NT、ox-LDL等。当然对AD的认识还在不断发展和深入探索AD生物标志物仍存在很大的机遇和挑战，需要用综合的思维和手段去分析研究，最终极有可能通过多种生物学标记物联合分析对AD患者作出一个明确的早期诊断。

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Biological indicators and the diagnosis of Alzheimer's disease.

PENG Yu,ZHOU Hua,QIU Chen-hong,SUN Qin-yi,WANG Feng,XIE Hong-na,ZHAO Zhong.Department of Neurology,Suzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Suzhou 215001,Jiangsu,CHINA

Alzheimer's disease(AD)is the most common cause of dementia.But so far,most patients of clinical identified Alzheimer's disease are mostly at the intermediate or advanced stage.No effective treatment is available to reverse existing deficits or to arrest disease progression.The prospect of effective treatment for Alzheimer's disease lies in early identification and early intervention.A series of recent studies has increased our opportunity to identify early Alzheimer's disease in patients.

Alzheimer's disease;Biological indicators;Nitrosative stress;Early diagnosis

R741

A

1003—6350(2013)01—0117—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.01.0053

2012-07-28)

南京医科大学科技发展基金面上项目(编号：2010NJMU107)；苏州市科技局社会发展基金项目(编号：SYSD2011110)

赵中。E-mail：zhaozhong1963@sina.com