微生物发酵法生产纤溶酶的研究进展

艾瑞波 刘晓兰,2 邓永平,2

AIRui-bo1 LIU Xiao-lan1,2 DENG Yong-ping1,2

李 琰1,2 何 宁1 王晓杰1,2 袁 欣3

LI Yan1，2 HE Ning1 WANG Xiao-jie1,2 YUAN Xin3

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省普通高等学校农产品加工重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3.齐齐哈尔市环境监测中心站,黑龙江 齐齐哈尔 161006）

(1.College of Food and Bioengineering,Qiqihar University,Qiqihar,Heilongjiang 161006,China;2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products,College of Heilongjiang Province,Qiqihar,Heilongjiang 161006,China;3.EnvironmentalMonitoring Center Station of Qiqihar City,Qiqihax,Heilongjiang 161006,China)

血栓栓塞性疾病主要是由于纤溶系统的异常所引起的[1]。血栓疾病的临床治疗方法主要有外科手术、抗栓疗法、溶栓疗法，近年来也探索了一些新型治疗手段，如超声波治疗、激素取代治疗、基因治疗、介入治疗、细胞治疗等，与其他治疗方法相比，溶栓治疗效果好、费用低[2-6]。目前临床已使用的溶血栓药物有链激酶(SK)、尿激酶（UK）、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）等，这些药物具有较好溶栓效果，但是还存在一些副作用[7-10]，而且价格昂贵。因此，急需研制出具有更高溶栓特异性、更高溶栓效率、更长半衰期、更小副作用的新型溶血栓药物。从现有报道来看，对新型溶栓药物的研究主要从以下两方面开展：①针对现有的溶栓药物的弊端对其进行修饰；②从生物代谢产物中分离溶栓活性成分，生产新型溶栓药物[11]。

纤溶酶指的是能够溶解构成血栓的主要成分纤维蛋白的酶。在生物化学中，纤维蛋白溶解简称为纤溶。在人体血液中，存在着凝血系统和纤维蛋白溶解系统，它们各受一系列酶促反应的调节，正常生理状态下，这两个系统保持动态平衡，既保证血液有潜在可凝固性，又保证血液的流体状态。纤溶系统主要由纤溶酶原、纤溶酶原激活剂（t-PA、u-PA）、纤溶酶和纤溶酶原激活物抑制剂（如PAI-1）这4个部分组成。纤溶的生物学作用之一是去除血管、组织液中过剩的纤维蛋白沉积物，以保持血循环、组织液管道等的通畅[12]。

微生物在自然界分布广泛，生长旺盛，繁殖较快，代谢产物繁多，而且发酵工业相对完善发达，占地面积小，可短期内得到大量目的产物，因此，微生物成为新型溶栓药物研发的主要来源。文章对已见报道的来源于微生物发酵的纤溶酶的发酵方法、纯化过程和酶学性质进行综述，并就研究中存在的一些需要解决的问题进行总结。

1 来源于霉菌的纤溶酶

霉菌是丝状真菌的总称，是酱曲中的优势生长菌，在生长代谢过程中能够分泌多种酶类[13]。目前见报道的霉菌发酵产纤溶酶大都是用豆制品加工下脚料作为主要培养基质。笔者所在课题组[14]报道了一种来源于根霉(Rhizopus chinensis)液态发酵产物的纤溶酶的纯化方法，以豆粕水解液和麸皮为培养基主要成分经过液态发酵生产纤溶酶，经过纯化后测得酶分子量为17.0 kDa左右。后来本课题组[15]又报道从一株脉孢菌固态发酵产物中得到了一种纤溶酶，体外溶解血纤维蛋白效果显著，菌株来源于南方小酒药，安全性较高，目前这两项研究成果已经获批了国家发明专利。研究人员[16]从镰刀菌培养液中先后应用盐析、离子交换和凝胶过滤色谱纯化了一种纤溶酶，分子量为27 kDa，最适作用温度为50℃，最适作用pH为9。闵伟红等[17]从中国传统发酵豆制品中筛选出一株具有产纤溶酶能力的枯青霉，以麸皮和豆粕为主要培养基质，优化固体发酵条件后获得纤溶酶活性达到873.76 U/g。也有研究人员[18]从菊花茎中分离到一株镰刀菌CPCC480097，经液态发酵得到纤溶酶Fu-P，分别经盐析、mono Q、Superdex75纯化了该纤溶酶。Norifumi Shirasaka等[19]从大米酒曲中筛选到黑曲霉KSK-3，经液态发酵制得纤溶酶，分别经盐析、超滤、一步离子交换、两步凝胶过滤色谱纯化了该纤溶酶。

2 大型食药用真菌来源的纤溶酶

大型食药用真菌含有多种生理活性物质[20-22]，作为重要的保健食品已经引起人们的广泛重视。近年来在大型食药用真菌代谢产物中又发现了一些种类的纤溶酶，由于利用大型食药用真菌生产纤溶酶安全性较高，同时其本身又具有重要的生理保健功能，因此大型食药用真菌成为筛选溶血栓药物的新资源。

早在2005年韩国学者[23,24]就报道分别从紫丁香蘑(lepista nuda)、密环菌的发酵产物中分别分离到了纤溶酶。Jae-Sung Kim等[25]分别应用一步离子交换色谱、两步凝胶过滤色谱从蛹虫草发酵液中分离得到一种分子量为52 kDa的纤溶酶，其纯化倍数和回收率分别为191.8和12.9%。Se-Eun Park[26]利用表面培养技术培养金针菇菌丝体，先后通过沉淀、两步离子交换色谱、两步凝胶过滤色谱从培养液中纯化了一种纤溶酶，回收率为0.69%，纯化倍数为18.52倍，酶分子量大约为37 kDa，最适作用pH为6.0，最适温度为30℃。沈明花等[27]利用和Se-Eun Park相似的流程从榆干离褶伞菌丝体中纯化一种分子量为50 kDa的溶栓酶，活性回收率为6.5%，最适作用pH为6.0，最适作用温度为35℃。崔莉等[28]从蛹虫草菌丝体发酵液中分离纯化出一种分子量为27.3 kDa纤溶酶，最适作用pH和温度分别为6.0和25℃。作者所在课题组[29]报道了蛹虫草深层培养产新型纤溶酶的纯化，采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25凝胶色谱、Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色谱、CM-Sepharose FF弱阳离子交换色谱和Superdex 75凝胶色谱对纤溶酶进行分离，最终获得两种高纯度的酶，其中纤溶酶I比活力达1 467.44 U/mg，纯化倍数为36.07，回收率为5.79%，纤溶酶Ⅱ比活力达1 681.58 U/mg，纯化倍数为41.33，回收率为4.00%，相对分子质量分别约为28 000和32 000。

3 细菌来源的纤溶酶

细菌生长旺盛，繁殖迅速，可以大大缩短纤溶酶的生产周期。1987年日本的须见洋行等从日本传统发酵食品纳豆中提取出具有溶血栓作用的纳豆激酶（NK）[30]。随后，中国学者相继从本国的发酵食品豆豉中分离到了产纤溶酶的枯草杆菌，豆豉纤溶酶具有良好的抗凝、溶栓作用，体内半衰期长，不引起机体内出血，而且可通过消化道直接吸收，有望被开发成为新一代溶栓、防栓药物[31]。

Wodeuk Kim 等[32]在枯草杆菌（Bacillus sp.CK-114）的代谢产物中分离得到了一种分子量为28.2 kDa的枯草激酶（CK），最适作用温度为70℃。顾昌玲等[33]从假蕈状芽胞杆菌B260发酵液中纯化到一种纤溶酶，测定了该酶的N-端序列，并与其他芽胞杆菌来源的纤溶酶的N端序列进行比对，确定同源性较低，但是未深入研究该酶的酶学性质。王成涛等[34]探讨了纤溶酶Subtilisin FS33的制备方法，固态豆豉抽提液经硫酸铵分段盐析，再经DEAE-Sepharose FF、Phenyl Sepharose FF、Sephadex G-50凝胶色谱纯化，得到电泳纯纤溶酶，纯化倍数和回收率分别为34.6倍和13.0%，分子量为30 kDa。Nack-Shick Choi等[35]从腌渍的凤尾鱼中分离到产纤溶酶的金黄色葡萄球菌，该菌分泌的纤溶酶具有较好的热稳定性，分子量为26 kDa，最适作用温度和pH为85℃和2.5～3.0。黎艳等[36]以海洋枯草芽孢杆菌FA-7为初发菌株，经UV诱变获得Y-22菌株，发酵液的纤溶活力为91 011.3 IU/mL，是出发菌株的3.05倍。和七一等[37]以粪肠球菌EF608为发酵菌株，利用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和酵母提取物为主要培养基质，37℃培养10 h，发酵液的纤溶活性达到1 833 IU/mL。Han-Young Cho等[38]报道从Aeromonas sp.JH1发酵液中分离到分子量为36 kDa的纤溶酶，最适作用温度和pH分别为40℃和8.0。

4 放线菌来源的纤溶酶

放线菌是生产抗生素的优势生物，国内外对放线菌产纤溶酶的研究甚少，现有的少量研究仅限于链霉菌发酵产纤溶酶方面，而且均止步于酶学性质研究，未深入研究溶解纤维蛋白的机制和功能。

早在1996年，法国研究人员[39]从链霉菌（Streptomyces sp.）发酵液中纯化到了纤溶酶。随后，中国和印度的研究人员[40,41]也分别报道从链霉菌(Strepcomycesmegasporus)发酵液中分离到了纤溶酶，并对产酶条件和酶学性质进行了研究。后来，又陆续发现了产纤溶酶的链霉菌。武临专等[42]对一株产纤溶酶的链霉菌C3662进行了菌种鉴定并对发酵条件进行了研究。Ratnakar R等[43,44]研究了嗜温链霉菌产纤溶酶的培养条件和部分酶学性质，确定该酶在体外37℃条件能溶解血液凝块，在后续研究中又以2.5 L发酵罐培养嗜温链霉菌产纤溶酶，利用HPLC研究纤溶酶降解纤维蛋白的情况，并就体外溶解血凝块试验与市售纤溶酶进行了比较。张立平等[45]利用纤维蛋白平板法筛选到一株高产纤溶酶的放线菌，但是未对该菌进行深入研究。汤祝华等[46]从豆豉中分离到白色链霉菌(Streptomyces albus)HS1，对该菌产纤溶酶的液态发酵条件进行了深入研究，确定以0.3%大豆粉、8%蔗糖、6.67%生豆浆为培养基主要成分，添加少量无机离子；发酵上清纤溶活性可达207.92 IU/mL。Ju Xiu-yun等[47]从链霉菌XZNUM 00004发酵液中经盐析、离子交换和两步凝胶过滤纯化了纤溶酶SFE1，分子量 20 kDa。

5 基因工程菌来源的纤溶酶

从自然界中筛选高产纤溶酶的微生物是随机的，有一些研究人员已经将研究方向与基因工程相结合，通过制备产纤溶酶的基因工程菌，定向获取专一性更高的溶栓药物。

焦龙等[48]报道了毕赤酵母工程菌pk53产纤溶酶发酵条件的优化，确定培养基组成为麸皮1.5%，豆粕粉2.0%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.05%；适宜发酵条件为接种龄14 h，接种量 1%，添加1.5%甲醇，250 mL三角瓶装液量30mL，菌体生长pH为5.5，诱导产酶pH为6.0；经过培养，纤溶酶活力可达到429.06 U/mL。Younes Ghasemi等[49]将枯草杆菌编码纤溶酶的基因进行了克隆，并研究了在大肠杆菌中表达该基因的条件。

6 纤溶酶研究中存在的问题

目前来看，微生物来源纤溶酶的研究过程中有几个问题需要解决：①发酵产酶活力还有进一步提高的空间；②在分离纯化过程中，色谱分离步骤较多，导致酶的回收率偏低；③大多数已见报道的纤溶酶的最适作用条件和人体生理条件不一致，因此，在其进一步应用研究中就会受到限制；④酶的纤溶功能性动物模型试验研究亟待深入进行，已见报道具有纤溶作用的酶活性研究仅限于体外在血纤维蛋白平板中对纤维蛋白（原）的水解作用，纤溶酶的体内溶栓报道尚不多见。因此需要进一步开展此类酶在体内的溶栓作用、抗凝血作用、对血液凝固时间（CT）的影响等研究，进而可以开展药理学、药效学、毒理学和药代动力学等方面研究，为研制出更高溶栓特异性、更高溶栓效率、更长半衰期、更小副作用的新型溶血栓药物奠定基础。

7 结论

一些霉菌、细菌、放线菌和大型真菌经发酵都可以产生纤溶酶，除了NK、CK研究较为深入，其它微生物纤溶酶的研究大多停留在分离纯化或酶学性质研究上。微生物来源的纤溶酶，特别是来自可食用微生物的纤溶酶，具有开发为保健食品原料、预防血栓用药和治疗血栓用药的潜力。

1 Bailey A L,Scantlebury D C,Smyth SS.Thrombosis and antithrombotic therapy in women arteriosclerosis[J].Arterioscler Thremb Vasc Biol.，2009,29(3):284～288.

2 Factor P.Gene therapy for acute diseases[J].Mol Ther,2001(4):515～524.

3 Tachibana K.Ultrasound therapy for stroke and regenerative medicine[J].Int Congr Ser,2004,1 274(10):153～158.

4 Sumino H,Ichikawab S,Sawadab Y,et al.Effects of hormone replacement therapy on blood coagulation and fibrinolysis in hypertensive and normotensive postmenopausal women[J].Thromb Res,2005,115(5):359～366.

5 张珺辉,赵兴全.肺血栓栓塞症介入治疗的研究现状[J].实用心脑肺血管病杂志,2006(2):98～100.

6 Wollert K C.Cell therapy for acute myocardial infarction[J].Curr Opin Pharmacol,2008,8(2):202～210.

7 Kunamneni A,Ravuri B D,Saisha V,et a1.Urokinase-a very popular cardiovascular agent[J].Recent Pat Cardiovase Drug Discov,2008,3(1):45～58.

8 杨新春,温绍君,李志忠,等.溶栓药物在动脉血栓栓塞性疾病中的应用及其评价[J].中华内科杂志,2006(6):522～523.

9 Yilmaz M B,Akin Y,Guray U,et al.Spontaneous rectus muscle hematoma following streptokinase therapy for acute myocardial infarction:a case report[J].Int JCardiol,2002,84(1):101～103.

10 邹和昌.溶栓剂的发展及研究[J].中国药学杂志,1997,32(5):263～267.

11 赵友春,赵淑梅,王革,等.第三代溶血栓药物研究进展[J].药学进展,2004,28（2）:72～75.

12 王鸿利,王学锋.血栓病临床新技术[M].北京:人民军医出版社,2003.

13 孙常雁.自然发酵黄豆酱中主要微生物酶系的形成及作用[D].哈尔滨：东北农业大学,2007.

14 Liu Xiaolan,Du Lianxiang,Lu Fuping,et al.Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Rhizopus chinensis 12#[J].Appl Microbiol Biotechnol,2005,67(2):209～214.

15 邓永平,刘晓兰,郑宏臣.应用Octyl Sepharose FF疏水层析分离好食脉孢霉发酵产生的纤溶酶[J].中国酿造,2009,19（10）:21～24.

16 Mitsuhiro Ueda,Toshihiro Kubo,Kazutaka Miyatake.Takumi nakamura purification and characterization of fibrinolytic alkaline protease from Fusarium sp.BLB[J].ApplMicrobiol Biotechnol,2007,74(2):331～338.

17 闵伟红,李佳,王影,等.高产纤溶酶霉菌固体发酵工艺条件的优化[J].食品科学,2008,29(1):207～211.

18 Bin Wu,LichengWu,Daijie Chen,et al.Purication and characterization of a novel fibrinolytic protease from Fusarium sp.CPCC 480097[J].J.Ind Microbiol Biotechnol,2009,36(3):451～459.

19 Norifumi Shirasaka,Masao Naitou,Kazuki Okamura,et al.Purification and characterization of a fibrinolytic protease from Aspergillus oryzae KSK-3[J].Mycoscience,2012,53(5):354～364.

20 Lindequist U,Niedermeyer TH J,Julich W D.The pharmacological potenial ofmushrooms[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2005,2(3):285～299.

21 Ng T B.Peptides and proteins of fungi[J].Peptides,2004,25(6):1 055～1 073.

22 Zaidman B Z,Yassin M,Mahajna J,et al.Medicinal mushroom modulatorsofmolecular targets as cancer therapeutics[J].Appl Environ Microbiol Biotechnol,2005,67(4):453～468.

23 Jun-Ho Kim.Purification and characterization of fibrinolytic enzyme from Lepista nuda[J].The Korean Journal of Mycology,2005,33(2):69～74.

24 Lee SY,Kim JS,Kim JE,et al.Purification and characterization of fibrinolytic enzyme from cultured mycelia of Armillariamelea[J].Protein Expres＆Pu,2005,43:10～17.

25 Jae-Sung Kim,Kumar Sapkota.A fibrinolytic enzyme from the medicinalmushroom Cordycepsmilitaris[J].The Journal of Microbiology,2006,12:622～631.

26 Se-Eun Park.Purification and characterization of a fibrinolytic protease from a culture supernatant of Flammulina velutipes mycelia[J].Biosci.Biotechnol.Biochem,2007,71(9):2 214～2 222.

27 沈明花,金成俊.榆干离褶伞纤溶酶的纯化及酶学性质研究[J].食品与发酵工业,2007,33(8):45～47.

28 Li Cui,Ming Sheng Dong,Xiao Hong Chen.A novel fibrinolytic enzyme from Cordyceps militaris,a Chinese traditional medicinal mushroom[J].World J.Microbiol Biotechnol,2008,24(4):483～489.

29 刘晓兰,张雯舒,郑喜群,等.蛹虫草发酵产物新纤溶酶的分离纯化[J].华南理工大学学报(自然科学版),2012,40(5):107～114.30 丁文惠,李建平,张宝娓,等.基因重组链激酶静脉溶栓治疗急性心肌梗塞临床研究[J].中国临床药理学杂志,2000,16(4):259～261.

31 侯静,赵敏,杨福明,等.豆豉纤溶酶的研究现状及发展前景[J].中国调味品,2009,34(1):22～26.

32 Kim W,Choi K,Kim Y,et al.Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced flom Bacillus sp.strain CK11-4scrcened from Chungkook-Jang[J].Appl Environ Microbiol,1996,62(5):2 482～2 488.

33 顾昌玲,郭晓军,李佳,等.一株产纤溶酶芽孢杆菌的鉴定及纤溶酶的分离纯化与性质分析[J].微生物学报,2009,49(4):492～497.

34 王成涛,籍保平,曹雁平,等.豆豉纤溶酶Subtilisin FS33的提取纯化与鉴定[J].中国酿造,2009,203(2):29～32.

35 Nack-Shick Choi,Jae Jun Song,Dong-Min Chung,et al.Purication and characterization of a novel thermoacid-stable fibrinolytic enzyme from Staphylococcus sp.strain AJ isolated from Korean salt-fermented Anchovy-joet[J].J.Ind Microbiol Biotechnol,2009,36(3):417～426.

36 黎艳,张兆峰,田苗,等.海洋纤溶酶高产菌株的选育及产酶条件优化[J].中国酿造,2012,31(2):33～37.

37 和七一,文浩平,张康,等.产纤溶酶菌株粪肠球菌EF608液体发酵工艺优化研究[J].食品工业科技,2012,33(15):165～168.

38 Han-Young Cho,Min Jeong Seo,Jeong Uck Park,et al.Detection of a unique fibrinolytic enzyme in Aeromonas sp.JH1[J].The Journal of Microbiology,2011,49(6):1 018～1 021.

39 Bono F,Savi P,Tuong A，et al.Purification and characterization of a novel protease from culture filtrates of a Streptomyces sp.[J].FEMSMicrobiol Lett,1996,141(2～3):213～222.

40 王骏,王敏,王以光.链霉菌产生的新型纤溶酶的纯化和性质的研究[J].生物工程学报,1999,15(2):147～153.

41 Chitte R R,Dey S.Potent fibrinolytic enzyme from a thermophilic Streptomycesmegasporus strain SD5[J].Lett Appl Microbiol,2000,31(6):405～410.

42 武临专,陈昉,王以光,等.一种产生纤溶酶的链霉菌C-3662的鉴定与发酵研究[J].微生物学报,2002,42(5):600～606.

43 Ratnakar R Chitte,Sabita Dey.Production of a fibrinolytic enzyme by thermophilic Streptomyces species[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2002,18(4):289～294.

44 Ratnakar Ravindra Chitte,Siddharath V Deshmukh,Pradnya Pralhad Kanekar,et al.Production,purification,and biochemical characterization of a fibrinolytic enzyme from thermophilic Streptomyces sp.MCMB-379[J].Appl Biochem Biotechnol,2011,165(5～6):1 406～1 413.

45 张立平,李术娜,袁洪水,等.纤溶酶产生菌的筛选及酶活力的测定[J].药物生物技术,2007,14(1):48～50.

46 汤祝华,朱春节,张宇,等.白色链霉菌 (Streptomyces albus)HS1产豆豉纤溶酶发酵条件优化[J].海南师范大学学报(自然科学版),2010,23(3):308～314.

47 Xiuyun Ju,Xiaoying Cao,Yong Sun,et al.Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from Streptomyces sp.XZNUM 00004[J].World JMicrobiol Biotechnol,2012,28(7):2 479～2 486.

48 焦龙,于宏伟,郭润芳,等.毕赤酵母工程菌pk53产纤溶酶发酵条件的优化[J].食品与发酵工业,2011,37(3):94～98.

49 Younes Ghasemi,Fatemeh Dabbagh,Abdollah Ghasemian.Cloning of a fibrinolytic enzyme (subtilisin)gene from Bacillus subtilis in Escherichia coli[J].Mol Biotechnol,2012,52(1):1～7.