锌离子在脑缺血中作用的研究进展

李 森 刘克建 赵咏梅

(首都医科大学宣武医院神经变性病教育部重点实验室北京市老年病医疗研究中心，北京100053)

锌元素是人体内含量丰富的必需微量元素之一，在皮肤、骨、肝脏、肌肉和脑中广泛存在。除参与组成细胞转导通路中的各种酶之外，锌对于保证这些蛋白的生物活性也是至关重要的。在神经系统，机体通过复杂而精确的调节机制使锌离子保持在正常浓度范围内发挥作用。过量的锌则有细胞毒性，可导致细胞凋亡［1］。

1 神经细胞内的锌稳态

有证据［2-3］表明，锌具有神经调节功能。在突触小泡转运过程中，锌离子被释放到突触间隙，然后可以通过邻近细胞的门控通道进入到细胞内。这些释放锌离子的神经元同时可释放谷氨酸，因此被称为“谷氨酸锌能神经元(gluzinergic neurons)”。锌离子经其转运体(Zn2+transporters，ZnTs)进入谷氨酸锌能神经元突起末端的突触囊泡，并和谷氨酸一起储存。正常刺激时，锌离子和谷氨酸一同释放入突触间隙，并作用于突触后通道蛋白如GABA受体、NMDA受体或电压门控通道等［3］。在诸多ZnT蛋白中，ZnT1和ZnT3在脑内的分布与富含锌的突触囊泡分布极为相近。用 ZnT3敲除小鼠的研究［1，4］证明，ZnT3 在锌离子向突触囊泡转运过程中是必须的。而ZnT1有助于锌离子向胞外转运，在一定程度上可以阻止锌离子的毒性作用。

锌的摄取和释放由胞膜上的转运蛋白介导，而锌的缓冲调节与一种叫做金属硫蛋白(metallothionein，MT)的蛋白家族有关［5］。有证据［5-6］证明，细胞内的锌离子聚集也来源于细胞内的储存结构，如线粒体等。MT是一种低相对分子质量的富含半胱氨酸和金属成分、缺少芳香族氨基酸的蛋白。半胱氨酸具有两个分别与锌相连的结构域，使得蛋白成哑铃状。在中枢神经系统中，MT1和MT2大多在胶质细胞中表达，而在神经元中非常少见。相反，MT3多在神经元中表达，由于其在脑内的广泛分布，MT3在神经元的锌稳态中发挥着重要的作用。

2 缺血时锌离子水平的改变

2.1 缺血时突触末端释放的锌离子从细胞外进入细胞

缺血时，大量的锌离子从突触末端释放出来，转移并聚集于突触后神经元内。研究［7］表明，在缺血开始后7 min即可观察到缺血区锌阳性细胞末端的染色变淡，直到缺血后第7天。锌染色的这种迅速减少直至最终消失与锌离子从突触小泡释放有关。Kitamura等［8］采用微量透析技术研究了细胞外锌离子水平的变化，观察到缺血期大鼠脑组织海马CA1区内锌离子的聚集。缺血后15 min，胞外锌离子水平达到了一个峰值(600 nmol/L)，是基础水平的2倍。随后，胞外锌离子水平下降并于再灌注后15 min回到基础水平，而海马CA1区锥体细胞在缺血24 h后出现胞内锌离子聚积。锌离子聚集的机制可能与文献报道［1-2］的谷氨酸盐聚集的机制相似，包括进行性突触前ATP水平的缺失、去极化以及突触小泡融合等。近来一项研究［9］提示，在动物模型或患者中，缺血后数小时乃至数天内重复扩散性的去极化很可能是锌离子聚集的重要原因。缺血脑片模型中突触锌离子释放的波形变化与去极化的传播相一致，使锌离子大量释放进入已受损的脑内［10］。

2.2 缺血时锌离子从胞内存储中释放

尽管有关脑缺血的体内研究多集中在突触囊泡中的锌元素，但近来很多的全脑缺血模型或者其他实验模型证实，缺血期胞内锌离子的聚积是突触释放和胞内存储释放协同作用的结果［6，11］。

Frederickson等［12］检测了缺血及再灌期细胞外锌离子水平的变化。缺血开始后，胞外锌离子水平与谷氨酸同步上升。然而，再灌注引起的锌离子释放无论在密度上还是时程上都比缺血更为强烈。由于再灌注引起的锌离子释放并不与谷氨酸释放相伴随，提示再灌注引起的锌离子释放来源于MT或线粒体等胞质内贮存锌的结构。

MT蛋白是含量丰富的锌缓冲蛋白，能结合大量的锌离子。缺血时产生的氧化应激和酸中毒可以诱导锌离子从MT释放，使胞内锌离子大量增加。这一过程已在培养的神经元中得到证实［13］，可以解释为什么在ZnT3敲除动物的海马锥体神经元中仍有锌离子的聚集，以及为什么敲除MT3可以减少痫性发作诱导的突触后锌离子上升［14］。

锌离子与MT的相互关系对神经元活性有多方面的影响。除在特定情况下释放锌离子造成毒性损伤外，MT3还能通过结合跨膜而来的多余锌离子发挥神经保护作用［15］。在局部缺血模型中，MT3敲除小鼠的损伤更为严重，可能由于这些小鼠不能将缺血过程中胞内其他锌储存位点释放的锌离子聚集并隔离起来，因而加重了损伤程度［16］。体外研究［17］证实，锌离子可以诱导蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)依赖的MT磷酸化，导致缺血时锌离子急剧上升。因此，目前还很难确定在不同的缺血模型中MT是有利还是有害。

像钙离子一样，锌离子也能聚集存在于线粒体基质中，这是锌离子毒性作用的重要基础。来源于线粒体的锌离子流可能通过去极化以及线粒体通透性转运 孔 (mitochondrialpermeability transition pore，mPTP)的开放直接导致胞质锌离子水平的上升［18］。除了MT蛋白及线粒体之外，锌离子也可能从胞内其他结合位点释放。明确MT蛋白、线粒体以及可能存在的其他胞内锌储存点之间的关系可以为控制缺血后锌离子水平的病理性上升提供理论依据。

3 缺血后锌离子对细胞代谢的影响

3.1 锌离子对线粒体功能有重要影响

病理性的锌聚集可以以多种方式影响线粒体功能。急剧的锌超载可引起严重的线粒体功能障碍及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产生，继而引起细胞坏死，而轻度的胞内锌超载则可能放大凋亡通路，导致细胞凋亡［13，19］。锌离子能导致培养的神经元线粒体肿胀及ROS释放［20］。尽管钙离子也能诱导线粒体出现相似的改变，但锌离子的作用更强烈。然而，目前有关锌离子诱导mPTP开放的研究结果并不一致，提示可能存在器官(肝、脑)差异性或者其他参与因素。

锌离子对线粒体的影响是复杂多样的。锌离子可抑制线粒体中电子的转运，并不可逆地阻断关键的线粒体酶，这一作用似与mPTP的激活有关［18］。而抑制线粒体ATP产生、刺激ROS产生及释放或者激活mPTP后释放促凋亡因子如细胞色素C或凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)等都可以诱导缺血损伤。一些在缺血模型中的研究［21］表明，内源性锌离子参与了线粒体功能障碍。在缺血起始阶段，螯合锌离子可以减少线粒体细胞色素C的释放及caspase3-激活。此外，在氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)的海马脑片中，内源性锌离子在OGD起始后短时间内聚集于线粒体，并导致线粒体膜电位的不可逆性缺失［22］。

3.2 作用于胞质中某些靶点抑制细胞代谢

除了对线粒体的直接作用外，锌离子对细胞的其他代谢功能也有影响。在培养的神经元中，锌离子能够激活PKC，诱导NADPH氧化酶的激活，并能诱导一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的活化以及超氧化物、氮化物和过氧硝酸盐产生［23］。锌离子也能调节缺血时AMPA通道和/或红藻氨酸(kainic acid)通道(Ca-A/K通道)GluR2亚基的表达，使得Ca-A/K通道对钙离子的通透性增加［24］。

自由基诱导的DNA链断裂导致DNA修复酶-多聚核糖聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase，PARP］的激活。PARP催化ADP核糖单位从NAD+到多种核蛋白产物，导致NAD+缺失、糖代谢受阻及继发性ATP 缺失［25］。文献［26］报道，暴露于 400 μmol/L 的锌离子可导致培养的皮质神经元PARP活化及NAD+缺失，且NADPH氧化酶、NOS或者PARP的阻断剂都能减轻锌离子对神经元的损伤。PARP的激活导致AIF从线粒体释放，AIF随后转移入核内并激发了非caspase依赖的DNA断裂和细胞死亡［27］。其他一些研究［28］则报道了PAR(PARP的多聚体产物)可以直接诱导AIF从线粒体释放。体内研究［29］表明，给予糖酵解的终产物丙酮酸可以消除前脑缺血后的代谢障碍并拮抗锌离子的神经毒性，起到神经保护作用，这可能与它可以绕过糖代谢受阻并能通过乳酸脱氢酶促进 NAD+再生有关［30-31］。Sirtuins是一类 NAD+代谢酶，其激活剂可以加剧NAD+缺失及锌离子的神经毒性，而其阻断剂则具有神经保护作用［32］。

除影响神经元的代谢外，锌离子对星形胶质细胞的ATP产生同样具有重要作用。锌离子造成的ATP减少反过来引起星形胶质细胞谷氨酸盐摄取障碍，这一作用可以显著增强缺血损伤中的兴奋性毒性。与神经元相似，星形胶质细胞的ATP缺失也由PARP活化引起［33］。锌离子在小胶质细胞的激活中也有一定作用，参与了缺血晚期的损伤，且锌离子在小胶质细胞中的作用同样与PARP激活有关［34］。

3.3 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)和转录因子在锌离子依赖的神经损伤中的调控作用

锌离子对多种细胞信号通路有重要作用，依赖于外周环境的不同，这些作用最终可以是保护作用，也可以是损伤作用。MAPKs在调节细胞存活、增生及死亡中有重要作用，并能被多种应激条件包括缺血等强烈激活。一些研究［35］表明，锌离子可以通过激活膜上 MAPKs家族尤其是 P38和 ERK(extracellular signal-regulated kinase)介导神经元损伤。

在培养的神经元中，胞内锌离子的聚集(很可能由MT蛋白或其他对氧化还原敏感的结合位点释放)可以导致p38 MAPK通路激活，使得膜上Kv2.1钾离子通道磷酸化并开放，钾离子电流增加、caspase裂解及细胞死亡［36］。尽管ERK1/2激活与细胞存活和分化有关，但其长期激活可促进细胞死亡［37］。研究［38］发现ERK1/2的激活参与锌离子诱导的神经细胞死亡。锌离子可能通过抑制磷酸酶的活性造成ERK的激活，导致线粒体功能障碍、转录因子如Egr-1或Elk-1激活，最终导致caspase非依赖的细胞死亡。而另一项研究［17］表明，锌离子调控的转录因子改变可能是预适应的机制之一，因此，缺血时锌离子的作用非常复杂。

4 锌离子在脑缺血损伤中作用的时相性

近期研究［39］表明，在大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型中，脑梗死半暗带区域内锌离子阳性细胞数目在再灌注24 h内随再灌注时间增加明显增多，且MCAO大鼠脑内锌离子阳性细胞数目与脑梗死体积比率呈正相关。锌离子对神经元的损伤似乎具有时相性。早期的锌超载对于决定细胞的存亡是很关键的。在有大量锌超载时，锌离子很有可能造成严重的线粒体功能障碍，钙稳态失调以及ROS释放，导致急性的细胞坏死［40］。如果神经元在急性缺血期幸存，后续的变化机制会更加复杂。由线粒体损伤或者NADPH氧化酶激活所致的氧化应激状态能够损伤核DNA，之后激活PARP。PARP的激活又导致了PAR的聚集以及NAD+的缺失，从而抑制代谢及线粒体功能［26］。随之而来的凋亡诱导因子AIF及细胞色素C的释放则引发了核DNA断裂及凋亡，造成轻度延迟性的神经元损伤(约数小时后)［27］。如果此时神经元依然存活，P38和(或)ERK1/2 MAPKs的激活可以导致相对慢性的凋亡及非凋亡性损伤(数小时至数天)［38］，或者锌离子依赖的转录抑制子REST的激活可以下调GluR2表达，导致钙/锌通透性AMPA通道数量升高及迟发性的神经退行性变(数天)［11，41］。最后，轻度的锌离子上升本身并不能造成损伤，但却诱导了重复的去极化播散。这使得神经元代谢负荷加重，并可导致神经元损伤。重复播散的去极化可能在卒中发生后数小时至数天内进一步加速锌离子释放及聚集。相反，轻度的锌超载可以激活预适应通路，进而降低脑组织对缺血的易损性［17，42］。由于缺血不同时间所致损伤的机制不同，因此研究者需要针对不同的靶点进行有效的干预治疗。

综上所述，锌离子在机体正常生理活动以及缺血状态下均有重要的作用，锌离子参与了脑缺血后的神经细胞损伤，但目前所发现的机制仍不完善，需要研究者继续深入探索。锌离子在缺血后神经损伤中的作用可能存在浓度差别并具有时相性，界定这个范围能为下一步的研究提供新策略，并为缺血性脑卒中的防治提供新的干预靶点。

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