表皮生长因子及其作用机制

胡莹莹，王 琦，陈 瑛

(哈尔滨师范大学)

0 引言

1962年，Cohen.S用羧甲基纤维素从雄性小鼠颌下腺腺管分离出纯化神经生长因子(NGF)后发现另一类物质可使新生小鼠眼睑早开、牙齿早萌、体重减轻和毛发生长延迟，他提纯了这种由53个氨基酸构成的单链多肽称之为表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)［1-3］.

1979年，Carpenter等人报道了人表皮生长因子(hEGF)的氨基酸残基组成［4］.同年，Gregory从人尿中发现了能够抑制胃酸分泌的抑胃素，称之为尿抑胃素(Urogastrone，UG)，并发现EGF与UG的化学结构与生物活性极为相似，于是人们把EGF和UG这两种多肽看成同一物质，一般称之为上皮生长因子—尿抑胃素(EGF—UG)［5］.随后，在大白鼠、猪等生物体中均发现了表皮生长因子mEGF和pEGF.

这之后关于EGF的生物学功能开展了大量研究.经研究发现EGF具有促进细胞分裂、与某些癌性病变密不可分，除此之外，对呼吸系统、生殖系统也有很重要的作用.尤其是EGF可以促进上皮细胞分裂增殖，Imanish J，Kamiyama K Iguchi等人在2000年发现应用EGF可以明显增加创面的内胶原和细胞DNA含量，加速创面愈合.随后EGF不论在临床应用还是美容领域都得到广泛应用.

近年来，对 EGF及其受体(EGF receptor，EGFR)的研究成为生物化学研究的热点之一，对于其作用机制、影响因子和如何提高其生物学功能进行了广泛的研究.

1 表皮生长因子家族、分子结构及其生物学效应

1.1 表皮生长因子家族

在发现EGF后的40多年时间里，又先后发现了一些与EGF密切相关的生长因子，大小都在50～80个氨基酸之间，被称为EGF家族.包括1976年Todaro和Delareo在肉瘤病毒转化的3T3成纤维细胞培养介质中发现一种具有EGF活性的生长因子，命名为转化生长因子 α［6］(transforming growth factor α，TGF α)、之后又发现了牛痘病毒生长因子［7］(vaccinia growth factor，VGF)、休普氏纤维瘤生长因子［8］(shope fibroma growth factor，MGF)、粘液瘤生长因子［9］(myxoma growthfactor，MGF)、两性调节蛋白［10］(ampiregulin)、双向调节素(arnphireguli，AR)、betacellulin(BTC)、epiregulin(EPl)、结合肝素的EGF样生长因子(heparin-bingingEGF-likeg-rowth factor，HB-EGF)、痘苗病毒生长因子(vaccinia virus growth factor，VVGF)等.

1.2 表皮生长因子的分子结构特点

EGF是最早确立结构的生长因子.1986年Bell等人通过基因克隆及重组分析，阐明了EGF的基因位点及其编码序列，小鼠和人的EGF基因均为单拷贝基因.编码小鼠和人EGF的基因分别位于第3号和第4号染色体的长臂上［11］.hEGF以hEGF-β和 hEGF-γ两种形式存在，hEGF-β和hEGF-γ两者有98%的同源性和相似的分子结构，而且它们作用于同一个受体，并产生相同的生物学效应.

EGF的mRNA序列由4871bp组成，编码一个1217个氨基酸残基的大分子蛋白前体，有一个长3621bp的开放阅读框，编码1207个氨基酸残基.EGF前体有两个类似疏水袋的序列，一个位于前体的N末端，作为生物合成时的信号肽，在转录后很快被除去;另一个在前体的C端附近的成熟EGF序列之后，由于这一疏水序列后又跟有一个含大量碱性氨基酸的短序列，因而这段序列可能是固定在膜上的跨膜蛋白，类似于一个跨膜受体，被广泛的认为EGF就是在膜表面通过蛋白酶水解后由前体加工而来.hEGF前体除具有产生成熟hEGF外，其可能本身也具有生物活性，如hEGF分子的C结构域可能与受体结合来刺激细胞增殖，也有人推测它可能作为一种膜蛋白，在离子转运及细胞识别中起识别作用［12］.

EGF家族的成员在一级结构上相差甚大，有30%的同源性，但在空间结构上具有一定的保守性［13］，EGF家族内存在着11个保守的氨基酸残基，其中完全保守的6个半胱氨酸残基，在分子内部形成3对二硫键，使得这些分子具有相似的空间构象，因而都能够与EGF受体结合，并且在生物学的功能上也表现出一定的相似性［14］，因此把它们归为一个家族，称为EGF家族.EGF家族的结构特征可以从两方面来认识:一是它的一级结构，从中人们发现了多种吸引广大学者的序列;二是它的空间结构，借助高分辨率的核磁共振(NMR)分析技术［15］已对EGF的空间构象有了更深刻的了解和认识.

成熟的hEGF是具有53个氨基酸残基的不可透析的单链多肽，等电点(PI)为4.6，分子量为6045Da，对热稳定，含 3 个链内二硫键［16］，从而在6～20、14～3l和33～42之间分别形成三个环，这些环状结构使EGF对蛋白酶具有较高的稳定性，活性中心位于48～53个氨基酸残基之间，该二硫键对EGF生物学活性的发挥起重要作用［17］.

成熟的小鼠表皮生长因子(mEGF)是一种水溶性、低分子量、对酸对热稳定、不可透析的单链多肽，由53个氨基酸组成，不含丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸，含有3个链内二硫键，分子量约为6040Da，等电点为4.6，消光系数(280nm)为30.9，沉淀常数 1.25s［18］.早期圆二色谱分析表明，mEGF的二级结构是致密的球状结构，其中约25%为β-片层结构，75%为无规则的螺旋卷曲，无α-螺旋.后经核磁共振(NMR)研究证实其肽骨架中仅存在反平行的 β-片层［19-20］.mEGF在盐酸胍中的伸展动力学研究表明，mEGF是已知的最稳定的蛋白之一.

EGF对热稳定，在-20℃中能保持长期稳定;在中性溶液中100℃煮沸30 min仍保持稳定，但在100℃的0.1NNaOH或0.2NHCI中失活.耐胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶的消化.EGF分子中不含丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸.第53位精氨酸和第52位亮氨酸常被蛋白酶去除，因此EGF氨基端40多个氨基酸即具有该因子的全部活性［21］.EGF分子的空间结构可分为相对独立的N段和C段，这两部分较为刚性，分别由两对和一对相对柔性的二硫键相连，因此两部分的空间位置相对可变，整个分子较为柔性.

1.3 表皮生长因子的生物学效应

EGF对表皮、间皮、内皮细胞在体内外都起作用，还影响组织器官的生长和分化.人们首次发现的EGF作用是能使乳鼠眼睑早开6～7 d，牙齿早萌5～6 d，并伴有牙齿体积减小现象.此外，EGF还可促进心包膜、肾被膜、胆管和肺的发育.

(1)促进上皮细胞分裂增殖

EGF具有促进细胞的增殖和上皮再生的功能，可以促进细胞有丝分裂以及糖、蛋白质、DNA、RNA合成，在临床上与很多疾病，如免疫性皮肤病、创面组织修复及牙周炎等的治疗密切相关［22］，而在毛发囊泡细胞、鳞癌细胞中EGF却有抗增殖效应;EGF可以明显的增加创面的内胶原和细胞DNA含量，具有促进创面愈合作用，如促进外伤、手术、烧烫伤及各种激光损伤等引起的皮肤创伤愈合中有明显的效果［23］;促进角膜上皮细胞的增殖，用来治疗角膜损伤.EGF强烈的表达于角膜上皮的深层细胞和角膜缘上皮细胞、部分结膜上皮细胞和结膜下结缔组织内成纤维细胞等眼表层组织.以自分泌或(和)旁分泌的方式与EGFR相结合，促进角膜损伤修复［24］;EGF是组织修复和细胞保护作用的内源性物质，在人类胃肠道、十二指肠粘膜溃疡愈合过程中起着十分重要作用［25］，在治疗肿瘤方面，最近国外用大量hEGF与毒素结合治疗神经胶质瘤、乳腺瘤、皮肤瘤，已取得一定疗效［26］.同时临床上还可以应用EGFR单克隆抗体拮抗EGF对人牙龈上皮细胞的促增殖作用，为防止牙周炎提出了新的思路及其理论依据.

EGF促进组织修复的功能越来越受人们的重视，已被用于角膜、胃、肠道、肝脏、骨骼、神经等多种组织创伤的研究［27］.其研究和技术的进展即将在临床上广泛应用.

(2)EGF与某些癌性病变密不可分

研究表明EGF与肿瘤有三方面的关系:①某些肿瘤细胞可以自分泌EGF［28］直接作用于胞膜上EGF受体，加速其无抑制地异常增殖.②EGF受体的氨基酸排列和组成，与某些癌基因的产物具有高度的同源性，如EGF受体与病毒致癌基因src家族的产物有同源性，因此EGF受体不依赖EGF也能被激活，这种受体的持续激活可导致细胞不断生长，这可能是导致细胞恶变的原因之一.③多种肿瘤细胞的EGF受体有过度表达现象，如鳞癌、多形性脑胶质细胞瘤、喉乳头状瘤等.

(3)EGF调节内分泌腺

EGF与多种内分泌腺之间有密切的相互调节的关系，可直接或间接影响多种内分泌腺的分泌.EGF 可以促进 GnRH、CRF、GH、ACTH、LH、hCG、hCS、PRL、皮质醇等的分泌，抑制翠酮、雌二醇、甲状腺素等的分泌.另外，EGF可刺激人骨肉瘤细胞分泌甲状旁腺激素样肽(PTH-like peptide)，并刺激成骨细胞合成前列腺素 E2(PGE2)，促进胃泌素、胆囊收缩素、促胰酶素等胃肠道激素的分泌，并参与消化机能的调节.

(4)对呼吸系统的作用

EGF可经自分泌或旁分泌方式对气道上皮细胞的功能进行调控.作为一种肺内调节肽，具有抗氧化保护作用.它可以上调γ-谷氨酰转肽酶的表达、加速外源性谷胱甘肽(GSH)向细胞内转运和促进GSH合成、提高细胞的抗氧化能力及清除活性氧等.EGF还可通过细胞内信号转导来调控原癌基因bcl-2的转导水平.此外，EGF对肺泡Ⅱ型细胞增生有明显的调控作用，如加速肺泡Ⅱ型细胞结构和功能分化，从而合成表面活性物质，促进胎肺成熟，进而参与肺损伤修复过程［29］.

(5)EGF在糖尿病及糖尿病肾病(DN)的发生发展中起重要作用

其检测对DN的早期诊断、病情分析及临床治疗有一定的理论价值.对EGF与糖尿病性腺轴的损伤关系的研究表明，胰岛素的作用部分由EGF调节;胰岛素或睾酮不足可导致EGF缺乏，而EGF缺乏可能是直接引起生精障碍的重要原因.

(6)EGF对生殖系统的主要作用

①影响睾丸发育和精子发生.②调节卵巢的发育与生殖功能.刺激卵母细胞发育、抑制人绒毛膜促性腺激素诱发的排卵效应、刺激颗粒细胞增殖、影响颗粒细胞的甾体激素分泌与肽类因子的分泌.③促进合子发育.④ 作为胚胎营养因子调节早期胚胎发育.既可通过EGFR提高早期胚胎卵裂率和囊胚发育率;又可活化Na/KaATP酶，加快囊胚腔内液体的积聚，促进囊胚腔的形成与扩展;还可间接地使肌动蛋白发生磷酸化，引起细胞粘着性以及胚胎卵裂球的分化发生改变.⑤通过激活胚泡和调节子宫接受性等途径启动胚泡植入.

(7)EGF作为具有神经营养活性的因子，在神经损伤后可以保护相应的背根神经节感觉神经元.此外，EGF还是一种脑肠肽神经递质.

2 EGF作用机制

EGF通过与其细胞膜受体结合，在细胞内传递中构成一个复杂的代谢网络，诱导受体自身磷酸化，激活受体酪氨酸蛋白激酶活性，催化多种底物蛋白酪氨酸残基(Tvr)磷酸化，启动、催化、维持与细胞生长、增殖有关的一系列生化过程.

2.1 基本作用机制

Ullrich等人［30-31］提出二聚体学说，即 EGF与EGFR结合后相邻受体相互靠近形成二聚体，聚集的受体相互进行催化，使自身酪氨酸磷酸化，从而使受体的激酶区激活的观点，该学说已得到了证实.

EGF首先与EGFR的胞外结合部位结合，导致受体分子发生二聚化，促使EGFR羧基末端的三个酪氨酸残基(Tyr)自身磷酸化位点发生磷酸化，使受体酪氨酸激酶活化，从而磷酸化受体本身及下游的信号分子;磷酸化的受体通过其磷酸化酪氨酸残基可与蛋白质的SH2结构域相互作用，结合胞内的信号转导分子.已知EGFR的活化可以使细胞内三磷酸肌醇和二酰基甘油增多，结果引起细胞内游离钙离子增多，激活磷酸蛋白激酶c和磷酸蛋白激酶A，从而介导各种信号转导途径，使细胞增殖和功能发生改变.诱导EGFR自身磷酸化的位点是在其羧基端1068、148、1173和氨基端一个位点的四个Tyr残基［32］.

关于信息传递的过程，目前认为这种信息传递是以逐级放大形式来进行的.即被激活的一级信息分子去激活下一级信息分子，以此类推，每一次传递都是激活过程.而磷酸化的受体激酶区一方面能特异地与配体结合被磷酸化，另一方面又启动另外的信息分子，依次将信息传递到效应分子，使细胞内第二信使三磷酸肌醇和二乙酰甘油增多，引起细胞内游离Ca2+增多，激活蛋白激酶C和腺苷酸环化酶，改变细胞的骨架结构，使细胞分化、分裂和增殖等.但时至今日，有关EGF的作用机理仍有许多问题有待进一步阐明.

2.2 三种蛋白酶的激活

(1)酪氨酸蛋白激酶(TPK)的激活:EGF受体的第三结构区具有特异性的TPK活性.对此酶底物的研究是了解EGF如何刺激细胞增殖的信号传导过程的关键所在，EGF与受体结合诱导受体磷酸化，激活TPK.EGFR不仅能自身磷酸化，而且还使依赖于Ca2+离子的蛋白质或磷脂酰肌醇的磷酸化.利用定位突变的方法已经证明:TPK磷酸化与否对酶活性有重要调节作用，高活性的TPK可促使细胞增殖或癌变.

(2)C激酶(PKC)的激活:EGF与受体结合从而诱导受体结构产生变化，通过G蛋白降低受体TPK活性，从而导致EGF与受体复合物的高亲合性结合快速下降，使受体受到功能上的下降调节，说明PKC活性与EGF密切相关，EGF表现的促细胞增殖、促癌作用有可能都是通过激活PKC来表现的，也可说明通过下降调节的反馈作用抑制了EGF受体促进细胞增殖的力.可能正是由于PKC这种反馈抑制作用才使得正常细胞中EGF受体不会导致细胞异常增生.

(3)CAPK的激活:可能核内EGF受体或OAG(1-油酰-2-乙酰-消旋甘油)以外的其它第二信使来增强NC3H/10的染色体蛋白激酶(CAPK)的活性，EGF对CAPK的活性的影响有助于说明核内EGF的作用过程.

以上三种蛋白激酶的激活，从而保障了EGF受体复合物的一系列生理功能［33］.

EGF的发现和研究的历史十分短暂，但其特殊的生物学效应决定了它的广泛应用.随着研究的深入和临床上的广泛应用，一些疑难病症，如重度烧伤、大面积创伤、消化道溃疡、角膜严重损伤等，均有望迅速治愈.甚至目前的一些不治之症:如神经损伤、恶性肿瘤、AIDS病等，也可能通过EGF的使用而有所缓解和恢复.可以预言，EGF的应用必将为今后生命科学研究带来重大的飞跃.

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