Wnt蛋白分泌机制的研究进展

李凤立 靳卫国

( 1.泰山医学院，山东 泰安 271016； 2.泰山医学院附属聊城医院，山东 聊城 252000)

人类疾病的发生发展是多因素、多环节共同参与的复杂过程，其中涉及多条复杂的信号转导通路。近年来，关于Wnt信号转导通路的研究越来越受到人们的重视。Wnt/β-catenin信号通路是人体内一条极为重要的信号转导途径，与胚胎发育密切相关，对细胞的生长、增殖、分化及凋亡等生物学行为具有重要的调控作用。Wnt信号通路调节细胞生长、发育和分化的多个重要环节，在正常情况下对胚胎发育和成人的部分组织形成和功能发挥起着重要作用，而当该途径紊乱异常时，会导致多种疾病的发生。随着对该信号转导通路的研究逐渐深入，现比较明确的Wnt信号转导通路中的靶基因包括细胞增殖调控基因、发育控制基因和与肿瘤发生相关基因，如在细胞周期中能加速G1/S期进程的c-myc、cyclin D1及抗细胞凋亡的基因survivin 等。Wnt信号通路紊乱与众多人类肿瘤的发生密切相关，目前有十几种目前已知的高发性癌变都源于Wnt信号转导途径的失调[1-4]。

1 Wnt信号通路的组成

Wnt信号转导通路至少存在下列路径:经典的Wnt/beta-catenin通路;非经典的Wnt通路、Wnt/Ca2+和Wnt/PCP等途径[5-6]。Wnt/β-catenin信号途径是已发现三条Wnt信号途径中研究最深入的部分，它的主要组分包括Wnt蛋白，卷曲蛋白(Frz)，散乱蛋白(Dvl或Dsh)，低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)，糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)，结肠腺瘤性息肉病蛋白(APC)，轴蛋白(Axin)，酪蛋白激酶 (CKI)，β-连环蛋白(β-catenin)，T细胞因子/淋巴细胞增强因子(TCF/LEF)等。在正常成熟细胞中无Wnt信号通路的转导，GSK-3β与胞内的APC、Axin、CKI、β-catenin形成多聚蛋白降解复合体降解β-catenin，阻断了其对下游靶基因的激活。当Wnt信号转导通路的信号配体Wnt蛋白结合膜受体Frz，并激活胞浆内的Dsh，而磷酸化GSK-3β，使其从降解复合体脱落，因而β-catenin不能正常降解而在胞浆内异常聚集，大量游离的β-catenin进入核内，与转录因子TCF/LEF结合而导致wnt信号转导通路的下游靶基因的转录激活。在这些成员中，Wnt 蛋白与Fz 的结合对整个通路起开关作用；β-catenin 则是该通路的一个关键成分子[7]。

过去的几十年，关于Wnt信号转导通路的研究主要集中在两个方面:(1)各种Wnt通路在靶细胞中的传递过程；(2)Wnt通路对靶细胞发育、分化即目标基因的激活表达过程的影响。然而，关于在该信号转导通路中类似开关作用的即有活性的Wnt蛋白在分泌细胞中是如何合成并被运输到胞外发挥作用的，在这个过程中Wnt蛋白是如何被赋予功能和发挥作用的等等，针对这方面的研究国内外均较少[8]。

2 Wnt蛋白的结构与功能

Wnt是由最早发现的2个基因组合而来的,即果蝇wngless(wg)基因及小鼠Int-1基因。从线虫到人类都有Wnt基因，现已克隆出19种Wnt基因家族的成员。Wnt蛋白是由350～400个氨基酸组成的分泌型糖蛋白，其蛋白序列高度保守且具有共同的特征。首先，都含有23个左右的高度保守的半胱氨酸(Cys)残基位点，这些Cys残基之间可以形成二硫键，指挥着Wnt 蛋白的正确折叠和运输。其次，Wnt蛋白都在特定位点被脂质化修饰和N-糖基化修饰，这些修饰直接影响着Wnt蛋白的加工和转运[9]。Willert等在转染Wnt3a基因的小鼠L细胞培养基中纯化小鼠Wnt3a时发现了另一种翻译后修饰方法，即N-末端的77位半胱氨酸被棕榈酰化(C77A)；Zhai 等也发现Wg被脂化修饰了；其中高度保守的半胱氨酸提示棕榈酰化可能是Wnt的基本特点。尽管它们的控制机制并没有完全阐明，但研究已证明，这些修饰位点的氨基酸发生突变后，Wnt蛋白不能分泌出胞，只能积累在胞内[9-10]。Wnt蛋白与相应受体的结合活化使Wnt信号转导通路得以开启。Wnt蛋白是一种调节细胞生长、发育和分化的分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌激活不同的Wnt 信号转导通路在靶细胞中发挥作用。但它的合成、成熟、运输及分泌是一个复杂的、高度监管的过程[11]。

3 Wnt蛋白的合成、成熟、运输及分泌

Belenkaya[12]研究表明wntless和retromer复合体在Wnt蛋白分泌中起关键作用。Wnt蛋白在内质网中合成并修饰后，被运输到高尔基体中，与高尔基体膜上的wntless组成复合物，一起被转运到细胞膜上并释放到胞外，而wntless通过某种途径内陷回收进入胞内。此时retromer复合体能够识别内吞的wntless，并把它回收到高尔基体中继续发挥作用，防止其通过溶酶体途径被降解[13]。

另外，Hausmann等[10]和Michaux等[11]研究也都提示wntless是Wnt蛋白分泌所必需的，且通过体内外基因干扰wntless实验发现wntless对其他蛋白质的分泌没有明显影响，如Hh。wntless在线虫和哺乳动物体内的高度保守性，以及在表达wnt蛋白的器官中wntless的保守性表达和wntless与Wnt蛋白绑定模式，均表明wntless是Wnt蛋白的忠实伴侣。免疫共沉淀实验也显示wntless和Wnt蛋白相互联系在一起[14]，也支持以上观点。在wntless突变型的果蝇中，wnt蛋白积累在胞内不能分泌出胞，Wnt 信号转导通路的下游信号通路的靶基因激活也被阻断，而其它的信号蛋白分子却不受影响，因此不难推测wntless能特异性协助Wnt蛋白分泌出胞。虽然wntless的作用机制目前还未阐明，但多数研究结果均提示它可能作为一种分选受体，特异性的协助Wnt蛋白从高尔基体运输到胞膜，或者还可能发挥修饰酶或分子伴侣的作用，协助wnt蛋白进行正确的折叠加工。而Wnt蛋白的某些修饰可能影响wntless对其的分选识别，影响Wnt蛋白的自分泌和旁分泌，调控Wnt信号转导通路在肿瘤发生、发展中的作用。wntless的回收或降解对Wnt蛋白的转运及分泌也是很重要的，但这种分选受体的平衡又依赖于胞内的retromer复合体的调控[5]。

Retromer复合物是一个多亚基组成的复合物，在哺乳动物中由分选亚基(VPs35、VPs29、VPs26)和锚接亚基(SNX1和SNX2)组成，它负责细胞中许多蛋白的运输与回收[16]。在wntless作用被发现的同时，另外有两个著名的实验室也证实retromer复合体也是Wnt蛋白分泌所必需。retromer复合体的关键亚基vps35突变后，Wnt 蛋白分泌出现障碍，并且这种效应具有特异性。由于功能类似，可以推测在Wnt 蛋白的分泌过程中wntless和retromer复合体可能一起发挥作用。Franch-Marro等研究证实，Retromer复合体能够分选回收wntless。wntless协助Wnt蛋白分泌出胞后，通过细胞内吞作用使其回收入细胞内核内体，这时Retromer复合体通过其分选亚基识别wntless，将wntless从核内体中逆向运输到高尔基体中，防止它经溶酶体途径被降解[17]。因此，可以推测Wnt 蛋白、wntless和retromer复合体形成的一个动态循环的模式：wntless协助Wnt 蛋白的分泌，retromer复合体分选回收wntless使其处于动态平衡中，共同保证着Wnt蛋白的正常分泌。在某种意义上考虑，控制或打破这个动态循环的平衡可以干扰wnt蛋白的功能性分泌，调控Wnt信号转导通路在靶细胞的作用。

鉴于基因干扰技术的成熟及广泛应用，我们可以通过该技术进一步研究调控Wnt 蛋白分泌的众多因素和复杂机制。Bugarcic等[18]研究提示retromer复合体在分泌Wnt蛋白的细胞中对wnt信号转导通路在细胞事件中也起着关键作用，尤其是对Wnt 蛋白的旁分泌。retromer复合体的亚基与TBC1D5和GOLPH3蛋白连接，在蛋白质从高尔基体的转运活动中发挥作用。有学者进一步研究表明在DC细胞中由于Vps35能回收核内体的wntless，使其返回高尔基体重新发挥协助Wnt蛋白出胞的作用，所以它参与Wnt蛋白分泌的过程是通过wntless间接发挥作用的；而且虽然VPs35被干扰，它只能影响wntless的回收，而新的wntless分子会不断的合成，因此wntless对Wnt分泌的影响作用更直接更明显[8，15]。Coudreuse等[19]研究支也持此观点，他们通过对HEK细胞中VPS35基因敲除的研究，发现wnt3A的分泌无明显变化。

4 Wnt信号转导通路的抑制剂研究

随着对Wnt 信号转导通路的深度研究，针对信号通路的各个层面分子的抑制剂也日益出现。经典Wnt 信号转导通路受体抑制剂由分泌蛋白sFRP家族(the secreted Frizzled-related family)和Dkk家族(the Dickkopf family) 构成, 通过结合Wnt 分子和竞争性结合辅助受体LRP5/6，从而有效抑制Wnt信号转导入细胞内, 发挥抑制经典Wnt信号通路的作用。其中sFRP家族包括sFRP、WIF-1、Cerberus和WISE，同时抑制经典Wnt信号转导通路和非经典Wnt 信号通路。而DKK家族只抑制经典Wnt 信号通路[20]。针对Wnt 蛋白合成分泌方面的抑制作用研究较少，可能是Wnt蛋白的很多生化特性有很多谜团未解决。与其它信号分子不同，如成纤维细胞生长因子(FGF)，转化生长因子(TGF)，Wnt 蛋白还不能进行大量的生产，广泛研究、分析等。还有Wnt 蛋白复杂的翻译后修饰和一系列高度特异性和研究较少的加工酶的修饰处理使得Wnt 蛋白结构功能的研究更加困难。随着第一个Wnt蛋白结构研究清楚后，更多的研究将焦点集中到Wnt 蛋白上，从Wnt 蛋白的合成到成熟、功能性分泌及介导的信号转导通路产生的复杂效应等过程正逐渐清晰[21]。如目前已证实Wnt 信号的激活必须Porcupine(Pro)参与，Pro对Wnt蛋白进行酰化并将它们锚钉到内质网膜上以刺激它们的转录后N-糖基化修饰，此过程对Wnt 蛋白的分泌是必需的[22]。

5 结 语

从已有的研究来看，经典Wnt 信号通路的启动蛋白即Wnt蛋白的合成分泌涉及多种相关因子之间相互作用，有多种复杂的机制参与促进其成熟及其有功能的分泌。对目前已发现的重要相关因子如wntless和retromer复合体等的具体作用机制并未完全阐明，而且可能还有未发现的相关因子在其中产生作用。从Wnt 信号转导通路的开关环节进行分析，对Wnt信号转导通路进行更加深入的研究。对wnt蛋白质的合成、成熟和功能性分泌进行研究，以寻求在这一系列过程中通过外界因素如酶学修饰、药物抑制、基因沉默等干扰因素影响Wnt 蛋白的脂化、棕榈酰化及糖基化修饰或干扰其定位、转运途径等，进而调控信号通路在疾病发生、发展中的作用，为今后人类肿瘤针对该信号转导通路开发新的肿瘤治疗药物提供更多的参考依据。

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