采后钙处理对双孢菇贮藏生理的影响

孙 娅，李志强，＋，王毓宁，张维敏，李鹏霞，*

（1.江苏省农业科学院，江苏南京 210014；2.国家农业科技华东（江苏）创新中心农产品加工工程技术研究中心，江苏南京210014；3.南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京210037）

双孢菇（Agaricus bisporus）属于伞菌目、伞菌科、蘑菇属，因营养丰富和味道鲜美而备受青睐。采收后的双孢菇由于组织柔嫩，含水量多[1]且菌盖无明显保护结构，采后易发生褐变、开伞等变化，严重影响其品质和货架期寿命[2-3]，常温下仅能保存3～4d[4]。随着种植面积的扩大和生产数量的增加，双孢菇的贮藏问题就显得尤为突出。因此，研究双孢菇采后贮藏保鲜技术，对延长其运输时间和货架期限，提高其采后经济效益具有重大的意义。采后钙处理已广泛地应用于果蔬保鲜中，主要包括苹果[5]、梨[6]、番茄[7]等；同时钙处理简单易行、成本低廉，而Ca2+绿色环保，无毒副作用，因此在生产上具有广泛的应用前景。适当浓度的钙能够维持细胞壁和细胞膜结构与功能的稳定[5，8-9]；降低果实呼吸强度、推迟后熟，减缓果实软化进程[10]；并能够提高过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）等与果蔬抗氧化相关的酶活性[11]，清除自由基减缓衰老。钙处理在食用菌保鲜方面的研究鲜见报道，主要集中在香菇[12]、金针菇[13]上，对双孢菇的研究目前尚未见报道。本文作者前期研究了不同浓度（0.5%、1.0%和2.0%）的氯化钙处理对采后双孢菇贮藏期间品质的影响，结果发现0.5%CaCl2处理可以有效的抑制呼吸强度、推迟呼吸峰的到来，并能减缓总糖、蛋白质、维生素C、原果胶含量的下降程度，抑制游离氨基酸和可溶性果胶含量的上升，处理效果最好，而高浓度的CaCl2（1.0%和2.0%）对细胞有一定的毒害作用，不利于贮藏保鲜。本文在前期工作的基础上，研究了不同浓度氯化钙对双孢菇采后生理的影响，进一步阐述了氯化钙对双孢菇的保鲜作用机制，为双孢菇贮藏保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双孢菇（Agaricus bisporus）由江苏宿迁双孢菇种植基地提供，采收后分层放置于包装筐内，以防挤压和机械伤害，并于2h内迅速运至江苏省农科院农产品加工所以供实验，选择颜色洁白、大小均匀、成熟度一致，无病虫害和机械损伤的健壮菇作为实验材料。

UV1102紫外/可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；TGL-18M上海卢湘仪离心机 上海沪粤明科学仪器有限公司；GZX-250BS-Ⅲ光照培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；HH-4恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理实验 设三个浓度处理：a.0.5%CaCl2（W/V）；b.1.0%CaCl2；c.2.0%CaCl2，清水处理做对照（CK），每个处理设定三个重复；实验材料去根后，在30min内开始处理，浸泡处理1min，小心捞出沥干，聚乙烯塑料薄膜包装以防失水，并贮藏于（温度0～2℃、相对湿度90%～95%）冷库中，每2d取样观察并测定相关生理指标，共计14d，每个指标重复3次测定。

1.2.2 指标测定

1.2.2.1 超氧阴离子自由基（O2-）产生速率测定 参照陈建勋和王晓峰[14]的方法。称取样品5g，加入10mL 65mmol/L pH7.8的磷酸缓冲液（PBS）研磨过滤，5000r/min离心10min。取上清液1mL，加入65mmol/L PBS 0.9mL，10mmol/L羟胺氯化物0.1mL（以PBS作空白）混合后，于25℃恒温水浴中培养20min。取上述培养液0.5mL，分别加入17mmol/L对氨基苯磺酸0.5mL，7mmol/L ɑ-萘胺0.5mL，25℃恒温水浴保温反应20min。加入1.5mL的正丁醇摇匀后，取正丁醇相测定530nm处的吸光值并根据NO2的标准曲线，计算出O2-的产生速率，单位用nmol/（min·g）表示。其中每个样品重复三次测定。计算公式：超氧阴离子自由基（O2-）产生速率=（n×V×1000）/（Vs×t×m×蛋白含量）。式中：n：标准曲线查得的超氧阴离子物质的量（μmol）；V：样品提取液总体积（mL）；Vs：吸取样品液体积（mL）；t：样品与羟胺反应时间（min）；m：样品质量（g）。

1.2.2.2 脂氧合酶（LOX）活性测定 参照Axelrod等[15]的方法并加以改进。取5g样品置于研钵内，加入10mL 50mmol·L-1PBS（pH7.0）冰浴研磨至匀浆，4℃15000r/min离心15min，上清液用于LOX活性的测定。3mL反应体系中包括亚油酸钠（100mmol·L-1）25μL，醋酸缓冲液（100mmol·L-1，pH6.0）2.775mL，酶液0.2mL，30℃下反应并于234nm处记录1min内的吸光值变化，单位用U/（g protein）表示。其中每个样品重复三次测定。

1.2.2.3 过氧化物酶（POD）活性测定 采用愈创木酚法[16]。样品（5g）加入10mL预冷的0.05mg·L-1PBS（pH7.0），冰浴研磨，4℃下12000r/min离心20min，所得上清液即为粗酶液；取上述酶液30μL，加入到内含20μL 40mmol·L-1H2O2、2.9mL 50mmol·L-1PBS（pH7.0）、50μL 20mmol·L-1愈创木酚的混合液中反应，对照用30μL 50mmol·L-1PBS（pH7.0）代替酶提取液。测定反应液在470nm处的吸光值，以OD470每分钟变化0.01光密度值作为一个酶活力单位，单位用U/（g protein）表示。其中每个样品重复三次测定。

1.2.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 采用氮蓝四唑（NBT）法[17]并加以改进。称取5g样品，加入10mL 62.5mmol·L-1PBS（pH7.8）冰浴研磨，于13000r/min 4℃离心20min，所得上清液即为酶液。在试管中分别加入3mL反应液（54mL 14.5mmol/L dl-甲硫氨酸中分别加入3μmol/L EDTA、2.25mmol/L NBT、60μmol/L核黄素溶液各2mL）和酶液0.02mL，混合后在光照培养箱内照光（8000lx）10min后立即避光，迅速测定560nm下的吸光值，以单位时间内抑制光化还原50%的NBT为一个酶活力单位，单位用U/（g protein）表示。其中每个样品重复三次测定。

1.2.2.5 过氧化氢酶（CAT）活性测定 参照曹建康的方法[18]。称取样品5g置于研钵中，加入10mL 4℃下预冷的PBS（pH7.0）研磨成匀浆后，转移并定容至25mL容量瓶。混合均匀后4℃下静置10min，取上清液4000r/min离心15min，所得上清液即为过氧化氢酶粗提液。反应液包括0.2mL酶液、1.5mL PBS、1mL H2O2，25℃预热后，逐管加入0.3mL 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定其吸光值，每隔1min读数1次，共测4min，以1min内OD240减少0.1的酶量为1个酶活单位，单位用U/（g protein）表示。其中每个样品重复三次测定。

1.2.2.6 多酚氧化酶（PPO）活性测定 参照汤章城[19]的方法。样品（5g）加入10mL预冷的0.05mg·L-1PBS（pH6.5），冰浴研磨，4℃下12000r/min离心20min，所得上清液即为酶液；在试管中依次加入1mL 0.1mmol/L邻苯二酚、3.9mL 50mmol/L PBS（pH6.5）、酶液0.1mL，对照用0.1mL 50mmol/L PBS（pH6.5）代替酶液。在30℃下反应2min，测定反应液在525nm处的吸光值，以OD525每分钟变化0.01光密度值作为一个酶活力单位，单位用U/（g protein）表示。其中每个样品重复三次测定。

1.2.2.7 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝G-250法[20]。称取样品5g放入研钵中，加10mL蒸馏水研磨成匀浆并转移到离心管中，用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，4000r/min离心15min，将上清液转移并定容至10mL，摇匀待测。以牛血清白蛋白做标准曲线，测定595nm下的吸光值，单位用mg/g表示。其中每个样品重复三次测定。

1.3 数据统计与分析

所有数据采用SPSS 15.0软件进行Duncan多重差异比较及相关性分析，当p＜0.05时，表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 钙处理对双孢菇超氧阴离子自由基（O2-）产生速率的影响

2.2 钙处理对双孢菇脂氧合酶（LOX）活性的影响

钙处理对双孢菇LOX活性有明显的影响，且随着贮藏时间的增加，LOX活性呈下降趋势（见图2）。其中，0.5%CaCl2处理下双孢菇LOX活性下降幅度最大，且在整个贮藏期间均低于对照，14d时为对照的89.27%；1.0%和2.0%的CaCl2处理与对照相比，不能有效地抑制LOX活性，14d时分别高于对照15.74%和36.66%。由此可以看出，0.5%CaCl2处理对双孢菇贮藏期间LOX活性有很好的抑制作用，能够减缓双孢菇的衰老。0.5%与2.0%CaCl2处理之间有显著差异（p＜0.05），而与对照和1.0%CaCl2处理之间差异不显著（p＞0.05）。

2.3 钙处理对双孢菇过氧化物酶（POD）活性的影响

如图3所示，与0d相比，不同处理下双孢菇POD活性呈现整体下降的趋势。其中0.5%CaCl2处理在第4d时POD活性为对照的1.68倍，比对照出现第一次最大值时提前了2d，随后下降又上升至第10d达到对照的1.97倍，14d时为对照的144.87%；1.0%CaCl2处理在第6d达到对照的1.09倍，随后下降，14d时达到对照的115.23%；2.0%CaCl2处理在第6d时POD活性低于对照0.71%，在10d达到对照的1.35倍，14d时为对照的87.13%。以上可知，0.5%和1.0%CaCl2处理能够迅速地提高POD活性，从而消除过氧化物，降低活性氧的伤害，进而维持双孢菇的贮藏品质，其中0.5%CaCl2处理效果最好。0.5%与1.0%CaCl2处理之间无显著差异（p＞0.05），而与对照和2.0%CaCl2处理之间差异显著（p＜0.05）。

2.4 钙处理对双孢菇超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

由图4可以看出，不同处理下双孢菇的SOD活性在贮藏过程中随着时间的延长呈现上升趋势。其中0.5%CaCl2处理在整个贮藏期间SOD活性均高于对照，14d时为对照的106.45%；1.0%CaCl2处理在第14d达到对照的97.72%，仅在12d处高于对照3.83%，其余时间SOD活性低于对照；2.0%CaCl2处理在整个贮藏期间均低于对照，14d时为对照的90.41%。由此可以看出，0.5%CaCl2处理更有利于保持双孢菇较高的SOD活性，减少活性氧对其的伤害，延缓双孢菇衰老。其中各处理之间无显著差异（p＞0.05）。

2.5 钙处理对双孢菇过氧化氢酶（CAT）活性的影响

随着贮藏时间的延长，不同处理下双孢菇的CAT活性呈现总体上升趋势（见图5）。0.5%CaCl2处理在整个贮藏期间CAT活性均高于对照，且在4d时高于对照2.90%，在第14d时为对照的102.19%；1.0%CaCl2处理在第6d时CAT活性高于对照2.25%，比对照出现第一次最大值时推迟了2d，其余时间均低于对照，14d时为对照的97.81%；2.0%CaCl2处理下CAT活性在整个贮藏期间均低于对照，且在第14d时为对照的87.98%，各处理在整个贮藏期间和对照相比差异不显著（p＞0.05）。由以上分析可知，0.5%CaCl2处理在贮藏期间增长幅度最大，且在贮藏期间均高于对照，说明0.5%CaCl2处理能使CAT活性维持在较高水平，进而清除H2O2的积累，有利于维持双孢菇细胞内自由基代谢的稳定性。

2.6 钙处理对双孢菇多酚氧化酶（PPO）活性的影响

从图6可以看出，双孢菇在贮藏期间PPO活性呈现下降趋势。0.5%CaCl2处理下降幅度最大，且在14d内均低于对照；1.0%CaCl2处理也能够在一定程度上降低PPO的活性，但在第4d和第8d均高于对照5.76%和52.34%，第14d时为对照的85.52%；2.0%CaCl2处理不能有效减少PPO的活性，在第14d高于对照9.83%。以上分析表明，0.5%和1.0%CaCl2处理均能降低双孢菇中PPO的活性，但0.5%CaCl2处理效果更好。其中对照与0.5%CaCl2处理之间有显著差异（p＜0.05），而与1.0%和2.0%CaCl2处理之间差异不显著（p＞0.05）。

3 讨论

3.1 钙处理对双孢菇O2-产生速率的影响

超氧阴离子（O2-）可直接作用于蛋白而进一步转化为对细胞核结构有破坏作用的活性氧，因此O2-的生成速率可以反映出植物细胞受损情况。徐炯达等研究[21]发现，热处理和钙处理均能明显地降低苹果梨果实贮藏期间O2-的生成速率。从实验中可以看出，0.5%的氯化钙处理能够有效地抑制双孢菇中O2-的产生速率，维持活性氧代谢，保护细胞膜结构，进而延缓双孢菇的衰老。

3.2 钙处理对双孢菇LOX酶活性的影响

脂氧合酶（LOX）在果实成熟和衰老过程中起着十分重要的作用。它以亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸为底物，启动膜脂过氧化，产生过氧自由基，进而破坏细胞膜结构，最终引起细胞的衰老和死亡。史兰等[22]发现0.5%CaCl2处理降低了冬枣LOX活性，延缓了冬枣的衰老过程。本研究中发现低浓度的钙处理（0.5%）对双孢菇LOX活性有很好的抑制作用，能够延缓双孢菇的衰老。

3.3 钙处理对双孢菇抗氧化酶（POD、SOD、CAT）活性的影响

过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）是一类普遍存在于植物中的抗氧化酶，其活性与植物的代谢及抗衰老能力有密切关系。其中POD能够催化植物组织中低浓度的H2O2氧化其他底物，从而清除H2O2，降低其对植物组织的毒害；SOD属于一类含不同金属离子的氧化还原酶，它能够清除组织代谢产生的活性氧，防止O2-的毒害作用，从而保护细胞膜结构和功能的完整性；CAT可以分解植物体内高浓度的H2O2，清除活性氧的伤害。实验结果表明，钙处理可以通过提高POD、SOD、CAT的活性，防止活性氧的积累，进而延缓双孢菇的衰老，延长运输和货架期限，这与王炜等[5]研究结论一致。综合分析表明，0.5%CaCl2处理与其他浓度相比效果最好，能够快速地提高双孢菇POD、SOD、CAT的活性，维持细胞内自由基代谢的稳定性，其中1.0%CaCl2处理能够提高双孢菇POD的活性，维持双孢菇的品质。

3.4 钙处理对双孢菇褐变过程中关键酶（PPO）活性的影响

双孢菇的褐变主要由酶促反应引起，在有O2条件下，多酚氧化酶（PPO）能将无色酚类化合物氧化成红褐色的醌，醌再进一步与氨基酸反应生成“类黑色聚合物”，从而导致双孢菇褐变，影响其品质。有研究表明，3%钙处理能够降低冷藏期间桃PPO的活性[23]，同时本实验结果表明，0.5%和1.0%CaCl2处理均能降低双孢菇贮藏期间PPO的活性，抑制贮藏过程中双孢菇的褐变，但0.5%CaCl2处理效果更好。

4 结论

研究发现，0.5%浓度的氯化钙处理能够有效的抑制O2-和LOX的产生、提高POD、SOD、CAT的活性，减少植物组织中PPO的产生，这可能是由于适当浓度的钙能够维持细胞结构，保护细胞膜的完整性，进而保持防御系统中酶的活性；同时使细胞清除活性氧自由基的能力增强，减少自由基对膜系统的损伤，延缓双孢菇的衰老过程[24]。1.0%CaCl2处理能提高POD的活性和降低PPO的活性，但对其他生理指标效果不明显；2.0%CaCl2处理效果不好，不能延缓双孢菇的衰老。由此可以看出，高浓度的CaCl2对细胞有一定的毒害作用，会造成双孢菇生理混乱，导致贮藏保鲜效果不理想。同时，据本文作者的前期研究结果表明0.5%CaCl2处理可以有效的抑制呼吸强度、推迟呼吸峰的到来，并能减缓总糖、蛋白质、维生素C、原果胶含量的下降程度，抑制游离氨基酸和可溶性果胶含量的上升；1%CaCl2处理能够推迟呼吸峰的产生时间，在贮藏后期（12～14d）抑制蛋白质含量的下降且0～4d时VC含量也高于对照；2%CaCl2处理下0～8d内总糖含量较高，12～14d时蛋白质含量高于对照。两者的研究结果较为一致。综合考虑，0.5%CaCl2处理可用于双孢菇的贮藏保鲜并在生产中具有推广价值。

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